在禽畜业中，枯草芽孢杆菌在固态发酵饲料中充当益生菌补充剂的应用成为研究热点。研究发现，枯草芽孢杆菌具有预防疾病、促进动物生长、抑制有害菌繁殖等益处[1-2]。但是，不同动物间肠道微生物的菌群种类和相对含量差异显著[3]，枯草芽孢杆菌饲料应用研究还不够深入，质量和稳定性有待提高，其在不同动物个体的添加量也难以确定。在肠道微生物激烈的竞争关系中，枯草芽孢杆菌凭借周生鞭毛能运动，耐酸碱能力强的优势，在有些动物个体中存在定植过量而扰乱微生物菌群生态平衡的风险。另外，枯草芽孢杆菌可内生形成抗逆性芽孢，对土霉素、庆大霉素、阿莫西林等多种抗生素均具有一定的耐受性[4-5]。因此，寻找有效抑制枯草芽孢杆菌的中草药，对解决个别动物肠道内枯草芽孢杆菌定植过量引发的菌群失衡问题具有重要意义。1材料与方法1.1试验材料药材：鱼腥草、马鞭草、艾叶、虎杖、乳香、莫荆子、麻黄、防风，均购自禹州市药材市场。试剂：琼脂、无水葡萄糖、酵母提取物、氯化钠、蛋白胨，均购自郑州政博科技有限公司。菌种：枯草芽孢杆菌由河南农业大学生命科学学院微生物学实验室提供。仪器：JA1003N电子天平购自上海菁海仪器有限公司；XY-100高速多功能粉碎机购自浙江省永康市松青五金厂；XFH-50CA电热式压力蒸汽灭菌锅购自浙江新丰医疗器械有限公司；Research Plus移液枪购自艾本德公司；DL-CJ-1N单人双面超净工作台购自北京东联哈尔仪器制造有限公司；LRH-150-G光照培养箱购自韶关市康宏医疗器械有限公司；TG16-WS离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。1.2试验方法1.2.1培养基的制备PDA固体培养基：土豆削皮，切成约1.5 cm×1.5 cm的小块，称取200 g，加水1 000 mL煮沸约30 min，使用玻璃棒稍用力能捣碎的程度；8层纱布过滤2次，滤液中加入20 g琼脂粉，煮沸，不停搅拌至完全融化；再加入20 g葡萄糖，融化后，溶液采用500 mL三角瓶分装，放入立式高压蒸汽灭菌锅内121 ℃灭菌20 min。灭菌后倒平板，使每个培养皿中的培养基约为15 mL，培养基凝固后放入37 ℃生化培养箱培养24 h，观察有无杂菌污染，以备待用。LB液体培养基：准确称取蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、氯化钠2 g，配制200 mL液体培养基，调节pH值至7.4，121 ℃灭菌20 min。1.2.2菌液的制备取出-20 ℃保存的枯草芽孢杆菌菌种，在PDA培养基表面划线，37 ℃培养24 h，挑取单菌落再次划线，如此3次复苏菌种。最后挑取1个单菌落接种于100 mL液体培养基中，37 ℃恒温培养至细菌生长到对数期，4 ℃冰箱保存备用，临用前稀释到约106 CFU/mL。1.2.3中药提取物的制备单方水提物的制备：8种中药粉碎，称取20 g，用过滤袋装好，放入三角瓶中，加入200 mL蒸馏水，塞上塞子，浸泡30 min；放入高压蒸汽灭菌锅，煎煮2次，每次30 min，合并2次煎煮液，加热浓缩，10 000 r/min离心2 min，得到终浓度为1 g/mL的中药水提物。1.2.4抑菌圈的测定在超净台中，把枯草芽孢杆菌菌液倒入无菌培养皿中，涂布器在酒精灯上灼烧，稍凉后，蘸取菌液在PDA培养基表面均匀涂布，无菌风吹干表面水分后，使用灭菌后的打孔器均匀打4个孔，采用无菌注射器针头挑出琼脂小块，移液器吸取少量融化后的PDA培养基滴入孔内封底，防止药液从孔底溢走。以无菌水为空白对照，每个孔内滴入100 μL药液，重复1次。静置20 min后，放入37 ℃恒温培养箱中，培养24 h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个抑菌圈60°方向交叉测量3次，求平均值。1.2.5最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定采用二倍稀释法进行，在11个1.5 mL的无菌离心管中分别加入100 μL LB液体培养基，在第1号离心管中加入100 μL中药水提物，用移液枪混合均匀，吸取100 μL加入2号离心管，以此类推，使艾叶、虎杖、乳香、麻黄中药的浓度分别为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.62、7.81、3.90、1.95、0.97 g/L。第11号离心管中不添加药物作为阳性对照。然后在每个离心管中分别加入2 μL枯草芽孢杆菌菌液，每种药物设置3个重复，混合均匀，放入37 ℃恒温生化培养箱中培养24 h，肉眼观察到无浑浊现象时对应的药物浓度，记录为最小抑菌浓度。在测得最小抑菌浓度的基础上，吸取100 μL均匀涂在PDA固体培养基上，继续培养24 h，观察枯草芽孢杆菌菌落生长情况，无枯草芽孢杆菌生长时对应的浓度，即为最小杀菌浓度。1.2.6不同pH值条件下体外抑菌试验艾叶、乳香、虎杖、麻黄水煎后，浓度为1 g/mL的情况下，把各中药的pH值依次调为3、4、5、6、7，以相同pH值的LB培养基为空白对照，做体外抑菌试验测定抑菌圈。1.3数据统计与分析采用SPSS 21.0软件t检验对试验数据进行统计分析，结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1中药水提物对枯草芽孢杆菌体外抑菌结果（见表1、图1）由表1和图1可知，与对照组相比，艾叶、虎杖、乳香、麻黄对枯草芽孢杆菌均有极显著抑制作用（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.001.T001表1中药水提物对枯草芽孢杆菌体外抑菌结果Tab.1In vitro antibacterial results of traditional Chinese medicine extraction 单位：mm项目对照组抑菌圈直径中药组抑菌圈直径鱼腥草7.00±0.047.00±0.04艾叶7.00±0.02B25.10±1.28A虎杖7.00±0.02B19.26±1.02A乳香7.00±0.08B28.92±1.48A麻黄7.00±0.02B21.66±1.06A马鞭草7.00±0.047.00±0.04莫荆子7.00±0.027.00±0.04防风7.00±0.047.00±0.02注 ：同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.001.F001图1中药水提物对枯草芽孢杆菌体外抑菌结果Fig.1Results of in vitro antibacterial effect of water extracts of various Chinese medicines on Bacillus subtilis注 ： A1为加入无菌水，其他为加入1 g/mL艾叶水煎提取物；B1为加入无菌水，其他为加入1 g/mL虎杖水煎提取物；C1为加入无菌水，其他为加入1 g/mL乳香水煎提取物；D1为加入无菌水，其他为加入1 g/mL麻黄水煎提取物。2.2中药水提取对枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度结果（见表2）由表2可知，乳香的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度最小，抑菌作用最好，艾叶和虎杖的作用次之。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.001.T002表2中药水提取对枯草芽孢杆菌MIC和MBC结果Tab.2Results of the MIC and MBC of Bacillus subtilis extracted from traditional Chinese medicine water extraction项目最小抑菌浓度MIC最小杀菌浓度MBC艾叶15.6262.50虎杖31.25125.00乳香3.9015.62麻黄125.00250.00g/L2.3不同pH值条件下中药水提物对枯草芽孢杆菌体外抑菌结果（见表3）由表3可知，在pH值3时，枯草芽孢杆菌的生长受到强酸性环境的抑制，抑菌圈直径约为12.56 mm（孔洞直径为7.00 mm）；但是在pH值4~7时，枯草芽孢杆菌的增殖不受pH值环境的影响；与对照组相比，艾叶、虎杖、乳香、麻黄的提取物在pH值4~7的环境下对枯草芽孢杆菌均具有极显著抑制作用（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.001.T003表3不同pH值条件下中药水提物对枯草芽孢杆菌体外抑菌结果Tab. 3In vitro antibacterial results of aqueous extracts of traditional Chinese medicines on Bacillus subtilis under different pH conditions组别pH值3pH值4pH值5pH值6pH值7对照组12.56±2.62B7.00±1.02Bb7.00±0.04B7.00±0.04Bb7.00±0.04Bc艾叶提取物处理组22.78±2.24A17.38±1.26Ab16.56±1.08A20.14±1.02Aa21.76±0.08Aa虎杖提取物处理组20.82±1.06A18.42±0.08Ab17.56±0.06A16.58±0.08Ab17.66±1.04Ab乳香提取物处理组23.30±1.36A18.64±1.04Ab16.78±2.42A15.48±1.02Ab15.06±1.26Ac麻黄提取物处理组21.62±1.08A21.04±0.56Aa17.10±0.68A15.68±0.82Ab13.76±1.38Ac注 ：同列数据肩标小写字母不同表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）。mm3讨论本试验中，琼脂孔洞法体外抑菌试验结果显示，在浓度为1 g/mL时，艾叶、虎杖、乳香、麻黄水提物对枯草芽孢杆菌具有显著的抑制作用。其中，艾叶富含精油以及多糖、黄酮等功能性成分，水提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和乙型伤寒沙门氏菌等致病菌在体外具有抑菌作用[6]。本试验中，琼脂孔洞法测得艾叶水提物对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径约25.10 mm（包含琼脂孔洞直径7 mm），其绝对直径与蒋志惠等[7]使用药敏片法测得的艾叶精油抑菌圈结果一致，最小抑菌和杀菌浓度的测定因艾叶存储时间和添加菌液浓度不同，结果略有差异。虎杖对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌等细菌均有明显抑制作用[8]，水提物对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌圈，最小抑菌和最小杀菌浓度较低。乳香抗癌、抗炎活性强，药理活性主要归因于挥发油和树脂酸成分，有诸多潜在药用价值，目前对乳香的研究偏重挥发油含量测定和定性分析方面[9]，其水提物对枯草芽孢杆菌的有效抑菌成分和定量分析方面有待深入挖掘。麻黄主要化学成分包括生物碱、黄酮、挥发油、有机酸、氨基酸、多糖和鞣质等，是麻黄碱提取的主要来源，具有抗病毒、抗氧化、免疫抑制等作用[10]。麻黄水提物浓度为1 g/mL时，对枯草芽孢杆菌具有明显抑菌圈，但是测得最小抑菌和最小杀菌浓度较高，其水提物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果不佳。艾叶、虎杖、乳香、麻黄在pH值为3~7时，体外对枯草芽孢杆菌均具有显著的抑菌作用，但在动物体内能否对动物原籍菌造成不良的影响、能否在动物临床中应用还有待深入研究。微生物对宿主具有营养、免疫的作用，同时影响着宿主的健康。动物的微生物种群是生物在长期的进化历程中形成的，只有与宿主在不同发育阶段保持着动态平衡的生理组合状态，才能保持机体康健。菌群失调指原籍菌群在生活环境内发生的定性或比例失调的异常变化。对于禽畜，消化道菌群微生态的平衡尤为重要。我国的微生态制剂开发研究起步晚，但发展很快。与其他益生菌相比，枯草芽孢杆菌具有热稳定性高和耐低pH值的优势，被生物技术公司用于工业规模化生产[11-12]。但枯草芽孢杆菌也是一种条件性致病菌，在体内定植过量会破坏原有的菌群平衡，在有些动物中可能会引起菌群失调，导致慢性肠炎等慢性病的发生。中草药中富含复杂的化学物质可以直接或者间接杀死病原菌，提高动物机体免疫力，中草药发酵液添加剂在动物生产中的应用研究也已成为热点[13]。为解决枯草芽孢杆菌定植过量的个性化问题，与使用抗生素相比，从中草药中筛选抑菌药物，显然是一种快速、安全、有效的方法。4结论本研究结果表明，艾叶、虎杖、乳香、麻黄水提物浓度为1 g/mL时，在体外对枯草芽孢杆菌具有明显的抑制作用，且pH值为3~7时，一直保持较高的抑菌活性；其中，乳香水提物对枯草芽孢杆菌的抑菌作用效果最好，艾叶、虎杖次之，麻黄水提取需要较高的浓度才能有效抑制枯草芽孢杆菌。