牦牛是青藏高原及其周边地区最重要的草食家畜，能够适应海拔3 000 m以上的极寒气候，为藏区同胞提供奶、肉等生活资料[1-2]。阿坝和甘孜藏族自治州位于川西北藏族聚居区。该地区生存着的大量牦牛，为牧民提供的牛奶及其奶制品。牦牛奶丰富的营养和独特风味备受牧民喜爱[3]。Bandyopadhyay等[4]报道，牦牛是产志贺氏毒素大肠杆菌的天然宿主，且肠道致病性大肠杆菌在牦牛奶及其奶制品中也检测到。然而，国内关于牦牛源大肠杆菌的报道相对较少。本研究主要对采自川西北高原牦牛粪便源大肠杆菌进行耐药性、生物被膜表型和Ⅰ类整合子的检测，以期为后续检测牦牛源大肠杆菌多重耐药性提供参考。1材料与方法1.1菌株来源412株大肠杆菌从川西北高原的阿坝和甘孜藏族自治州的牦牛繁育基地和成都青白江区牦牛屠宰场的健康牦牛粪便样本分离。大肠杆菌标准株ATCC25922由西南民族大学兽医药理学实验室保存。1.2抗菌药物14种抗菌药物恩诺沙星、阿米卡星、庆大霉素、多西环素、氟苯尼考、安普霉素、阿莫西林、卡那霉素、利福平、左旋氧氟沙星、磺胺嘧啶、头孢噻肟、头孢曲松和头孢噻呋，均购自上海源叶生物科技有限公司。1.3分子生物学试剂普通PCR分子生物学试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。1.4试验方法1.4.1最小抑菌浓度（MIC）的测定试验分析参考NCCLS推荐的微量肉汤稀释法，对412株大肠杆菌进行14种抗菌药物最小抑菌浓度测定，试验结果利用WHONET 5.6软件统计分析。1.4.2生物被膜形成试验参考文献[5]的方法，采用改良结晶紫染色方法对生物被膜进行半定量测定。操作步骤如下：37 ºC条件下，所有菌株在聚乙烯96孔板内培养24 h，灭菌去离子水浸没洗涤2次。96孔板孔内黏附的细菌用0.2 mL无水甲醇固定20 min，弃去甲醇并自然风干。每孔加入0.2 mL 2.5%结晶紫染色10 min。弃去多余的染料后用灭菌去离子水洗涤3次。过夜风干后每孔内加入160 μL 33%冰乙酸溶解染料，利用ELX800酶标仪在570 nm处测定各孔OD值。试验重复3次。1.4.3I类整合酶基因PCR检测根据说明书操作步骤，采用商业化试剂盒对过夜培养的大肠杆菌进行基因组DNA提取。intI1基因的引物序列参考Bass的方法：intI1-F：5'-CCTCCCGCACGATGATC-3'和intI1-R：5'-TCCACGCATCGTCAGGC-3'[6]。25 μL标准反应体系包括2 pmol intI1引物、10 nmol dNTP混合物、50 ng DNA模板和1U ExTaq DNA多聚酶。intI1基因扩增步骤：94 ºC条件下预变性10 min；94 ºC预变性45 s，56 ºC条件下退火30 s，最后72 ºC延伸45 s，30个循环；94 ºC条件下延伸10 min。2结果与分析2.1牦牛源大肠杆菌MIC和耐药菌株数量（见表1）从481份粪便样本中共分离鉴定大肠杆菌412株，分离率为85.65%（412/481）。由表1可知，分离菌株对利福平、氟苯尼考和头孢噻呋的耐药率较高，多西环素和庆大霉素次之，对氟喹诺酮类恩诺沙星和左旋氧氟沙星的耐药率在30%以上。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.005.T001表1牦牛源大肠杆菌MIC和耐药菌株数量Tab.1MIC and No. of resistant strains for Escherichia coli isolated from yaks项目MIC50/(μg/mL)MIC90/(μg/mL)MIC范围耐药菌株数量/%阿米卡星4.002561~25686（20.8）阿莫西林16.00324~128134（32.5）安普霉素8.00322~512165（40.0）多西环素8.00640.062 5~256.000 0199（48.3）卡那霉素8.002561~256155（37.5）利福平8.00322~256391（95.0）恩诺沙星0.25320.016~64.000162（39.2）左氧氟沙星0.50160.008~64.000127（30.8）庆大霉素4.00640.125~64.000189（45.8）氟苯尼考16.002562~256364（88.3）磺胺嘧啶1.0040.016~64.000172（41.7）头孢噻肟4.002560.016~256.000168（40.8）头孢噻呋8.00160.031 25~16.000 00220（53.3）头孢曲松1.00640.016~256.000155（37.5）2.2生物被膜半定量检测结果（见图1）参考文献[7]方法，根据ODs值大小将412株大肠杆菌的生物被膜形成能力分为4种不同的表型：无成膜能力、弱成膜能力、中等成膜能力和强成膜能力。由图1可知，大多数菌株表现出弱的生物被膜表型，占菌株总数的57.52%（237/412）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.005.F001图1412株牦牛源大肠杆菌生物被膜形成能力Fig.1Biofilm-forming ability of 412 Escherichia coli isolated from yaks2.3牦牛源大肠杆菌intI1基因PCR扩增结果（见图2）由图2可知，127株大肠杆菌扩增到intI1约280 bp，占菌株总数的30.82%（127/412）。127株大肠杆菌中，仅有1株无成膜能力，其他菌株表现出不同的生物被膜形成能力。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.005.F002图2牦牛源大肠杆菌intI1基因PCR扩增结果Fig.2intI1 amplification results of the Escherichia coli isolated from yaks注 ： M为DL2000marker；N为阴性对照；1~5为牦牛源大肠杆菌。3讨论本研究中，从采自481份牦牛粪便样本中共分离鉴定大肠杆菌412株。MIC结果显示，分离菌株对选用的抗菌药物的耐药水平较高，对利福平、氟苯尼考和头孢噻呋的耐药率分别为95.0%、88.3%、53.3%；多西环素、庆大霉素次之，耐药率分别为48.3%和45.8%；其他9种抗菌药物的耐药率菌株45%以下。在所有的试验药物中，分离菌株对阿米卡星的耐药率最低，为20.8%。此外，本研究结果表明，30%以上的菌株对氟喹诺酮类恩诺沙星和左旋氧氟沙星的耐药率，高于Kijima-Tanaka等[8]的研究结果。57.52%的菌株表现出弱生物被膜形成能力，30.82%的菌株携带Ⅰ类整合子基因。试验结果也表明，intI1基因阳性菌株表现出对磺胺嘧啶、安普霉素、多西环素和庆大霉素耐药的多重耐药表型。尽管本研究分离的菌株来源于健康牦牛，然而由于抗生素的滥用和不正确合理用药仍然存在耐药菌株，而且大肠杆菌能够在抗生素持续压力下形成生物被膜以逃避抗生素的渗透和机体免疫系统的清除。以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌多重耐药性与整合子和生物被膜形成息息相关，它们可以在自身重组酶的作用下交换抗生素耐药基因。研究表明，大肠杆菌生物被膜的形成与多重耐药基因和毒力基因存在相关性[9-12]。基于本研究的试验结果，在后续的工作中，将重点关注在不同抗生素选择压力下，大肠杆菌生物被膜形成、耐药谱型和整合子之间的相关性，以阐明生物被膜的形成对大肠杆菌耐药性的影响及作用机制。4结论本试验研究结果表明，从481份牦牛新鲜粪便样本中分离鉴定412株大肠杆菌，分离菌株对利福平、氟苯尼考和头孢噻呋的耐药率较高；多西环素、庆大霉素次之；对其他9种抗菌药物的耐药率均在45%以下，其中对阿米卡星的耐药率最低（20.8%）。412株大肠杆菌中，57.52%的菌株表型出弱生物被膜形成能力，30.82%的菌株携带Ⅰ类整合子基因，intI1基因阳性菌株对磺胺嘧啶、安普霉素、多西环素和庆大霉素等表现出多重耐药。