目前，畜禽养殖逐步向规模化发展[1]。在畜禽养殖业中寻找抗生素有效的替代物已成为研究重点，肠道益生菌的开发研究成为当前热点[2]。饲料中添加微生态制剂可以提高饲料利用率[3]，减少粪尿中氮的排放，抑制有害气体的产生，是实现源头减排的有效手段[4]。在蛋鸡的肠道中，存在多种微生物[5]，以往对蛋鸡肠道微生物的研究主要有微生物培养和DGGE技术，这2种技术均有不足，因此高通量测序技术应运而生。高通量测序技术能够深入地观察细菌多样性。本试验中，通过对肠道菌群进行高通量测序和分析，旨在研究微生态添加剂对蛋鸡肠道微生物群落结构的影响，为蛋鸡的健康养殖、提高肠道免疫能力、预防疾病发生以及微生态制剂的开发提供参考[6]。1材料与方法1.1试验材料试验所用的微生态制剂由南京市福润德有限公司生产，主要成分包括枯草芽孢杆菌（≥1×1012 CFU/kg）、丁酸梭菌（≥1×1010 CFU/kg）等。1.2试验设计选择健康120日龄淮南麻黄鸡，随机分成4组，每组6个重复，每个重复5只鸡。各组依次添加0、0.5、1.0、2.0 g/kg的微生态制剂。基础日粮组成及营养水平见表1。试验期为40 d。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.T001表1基础日粮组成及营养水平Tab.1Basal diet composition and nutritional level原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米62.14代谢能/(MJ/kg)12.47豆粕16.38粗蛋白/%15.41棉粕4.99钙/%3.57菜粕3.01有效磷/%0.49鱼粉1.59赖氨酸/%0.80菌丝蛋白2.01蛋氨酸/%0.43石粉7.33碳酸氢钙1.02食盐0.33预混料1.20注 ：预混料由溧阳市久和饲料有限公司提供。试验在南京市畜牧家禽科学研究所种鸡场进行，蛋鸡舍为全封闭，饲养模式为层叠式笼养。1.3测定指标及方法试验结束后，每组屠宰3只鸡放血，取肠道（直肠和盲肠）食糜，送至南京市美吉生物公司进行微生物群落多样性分析。选用引物Nobar 431F和Nobar 609R来扩增的细菌，测序平台为：Miseq2*300。Miseq测序平台先对序列质量进行质控和过滤操作，然后进行OUT聚类和物种分类学分析。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OUT代表序列进行分类学分析，能够显示物种多样性以及多组样本之间的差异。在OUT聚类分析的基础上利用MEGAN分析，能够显示每个层级上各样本菌群丰度。1.4数据统计与分析采用Excel 2019软件对原始数据整理，采用SPSS 26.0软件进行显著性分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。使用美吉生信云平台对测序结果进行绘图。2结果与分析2.1稀疏曲线与香农指数（shannon）分析（见图1、图2）通过处理使样本序列长度不低于500 bp，以满足数据分析的要求。图1与图2分别是样本的稀疏分析图与shannon指数分析图（Z代表直肠组，M代表盲肠组），其中每条曲线代表1个样本。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.F001图148个试验样品的稀释曲线分析图Fig.1Analysis of dilution curve of 48 test samples注 ： Z1~Z4代表直肠组，M1~M4代表盲肠组；下图同。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.F002图248个试验样品的shannon指数Fig.2Shannon analysis of 48 test samples由图1可知，样本的稀疏曲线均未达到平台期，表示随着序列数增加相应OUT数量也会增加。由图2可知，shannon曲线趋平说明微生物多样性已经饱和。测序量增大或许会有新的种系，但多样性已经饱和，说明本次测序数据量够大，测序结果能够充分反映微生态添加剂对蛋鸡肠道菌群结构的微生物物种信息。2.2Alpha多样性分析（见表2~表4）通过Alpha多样性分析可以得到群落中物种丰度、覆盖度和多样性等信息。由表2可知，盲肠组肠道微生物Alpha多样性不显著，组间无显著差异（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.T002表2微生态添加剂对蛋鸡盲肠Alpha多样性的影响Tab.2Effect of microecological additives on Alpha diversity of the caecum of laying hens项目M1M2M3M4P值(M1~M3)P值(M1~M2)P值(M1~M4)shannon指数4.273.794.424.100.380.810.81simpson指数0.040.130.030.070.130.940.81ace指数521.82505.73559.83565.130.381.000.38chao指数527.41516.66584.99580.050.170.940.38注 ：Z代表直肠组，M代表盲肠组；下表同。由表3可知，Z1、Z2组肠道微生物shannon指数差异显著（P0.05），其余组差异不显著（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.T003表3微生态添加剂对蛋鸡直肠Alpha多样性的影响Tab.3Effect of microecological additives on Alpha diversity of the rectum of laying hens项目Z1Z2Z3Z4P值(Z1~Z2)P值(Z1~Z3)P值(Z1~Z4)shannon指数1.102.221.361.880.051.000.81simpson指数0.570.310.540.460.090.810.58ace指数312.54364.27344.58394.090.470.940.81chao指数247.34341.04282.28343.820.230.810.69由表4可知，M组与Z组在shannon、simpson、ace、chao、coverage上均存在显著差异（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.T004表4肠道微生物Alpha多样性Tab.4Diversity alpha intestinal microflora项目M组Z组shannon指数4.15±0.27a1.64±0.50bsimpson指数0.06±0.05b0.37±0.12aace指数538.13±28.96a353.87±34.26bchao指数552.28±35.25a303.62±47.04b注 ：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05）。在蛋鸡直肠和盲肠中，盲肠组shannon指数高，simpson指数低，表明微生态制剂对蛋鸡盲肠微生物群落有影响，使其群落丰度增加，但对其菌群多样性无影响。2.3微生物群落结构分析2.3.1微生态制剂对蛋鸡肠道中微生物群落门水平上丰度变化的影响（见图3、图4、表5）由图3可知，盲肠中，门水平优势微生物群落按其丰度排序为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）；直肠中，厚壁菌门（Firmicutes）为门水平的优势菌群。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.F003图3肠道微生物在门水平上的分度图Fig.3Phylum level division of intestinal microorganisms由图4可知，添加微生态制剂在蛋鸡肠道中微生物群落丰度变化在门水平上主要有变形杆菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chlorcfiexi）、厌氧菌门（Halanaerobiaeota）、放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、脱硫杆菌门(Desulfobacterota)、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、互养菌门（Synergistetes）等。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.F004图4肠道微生物在门水平上的热图Fig.4Phylum level of intestinal microorganisms由表5可知，添加微生态制剂蛋鸡肠道菌群在门水平上主要有：厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、放线菌门（Actinobacteria）和其他一些占比较少的细菌门类。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.T005表5微生态添加剂对肠道微生物群落在门水平上丰度的影响Tab.5Effect of microecological additives on the abundance of intestinal microbial community at the phylum level项目M组Z组厚壁菌门（Firmicutes）50.77±5.3646.99±3.40变形菌门（Proteobacteria）17.08±2.68b32.07±2.26a拟杆菌门（Bacteroidetes）11.04±0.98b24.01±1.64a疣微菌门（Verrucomicrobia）21.96±1.25a10.37±0.89b放线菌门（Actinobacteria）1.39±0.221.23±0.28未分类的菌门（unclassfied）0.01±0.040.04±0.04%2.3.2微生态制剂对蛋鸡肠道中微生物群落科水平上丰度变化的影响（见图5、图6、表6）由图5、图6可知，毛螺菌科（22.55%~20.61%）和拟杆菌科（23.21%~18.62%）主要组成蛋鸡肠道中的厚壁菌门。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.F005图5肠道微生物在科水平上的分度图Fig.5Family level division of microorganismsXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.F006图6肠道微生物在科水平上的热图Fig.6Family level thermogram of microorganisms由表6可知，丛毛单胞菌科（9.32%~2.56%）、莫拉菌科（4.71%~1.09%）和假单胞菌科（5.32%~4.01%）主要组成变形菌门。丛毛单胞菌科和莫拉菌科变化显著（P0.05）；拟杆菌科（23.21%~18.62%）、紫单胞菌科（6.37%~4.58%）和理研菌科（3.98%~1.67%）主要组成拟杆菌门，其丰度有显著变化（P0.05）；疣微菌科（26.31%~17.82%）主要组成疣微菌门，组间丰度有显著变化（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.T006表6微生态添加剂对肠道微生物群落在科水平上丰度的影响Tab.6Effect of microecological additives on the abundance of intestinal microbial community at family level项目M组Z组毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）20.61±1.2422.55±2.39瘤胃菌科（Selenomonadaceae）19.27±2.7920.30±1.17疣微菌科（Tannerellaceae）26.31±2.33a17.82±0.69b拟杆菌科（Bacteraidaceae）23.21±0.79a18.62±0.51b紫单胞菌（Peptostreptococcaceae）4.58±0.29a6.37±0.49b丛毛单胞菌科（Lachnaspiraceae）2.56±0.66a9.32±0.68b莫拉菌科（Freotellaceae）4.71±0.52a1.09±0.43b假单胞菌科（Ruminococcaceae）5.32±0.254.01±0.19理研菌科（Lactobacillaceae）1.67±0.18a3.98±0.19bRikenellaceae1.27±0.161.40±0.12其他15.61±1.29a22.74±1.63b%2.3.3微生态添加剂对蛋鸡肠道中微生物群落在属水平上丰度变化的影响（见图7、图8、表7）由图7、图8可知，拟杆菌属（Bacteroides）和乳杆菌属（Lactobacillus）是直肠和盲肠属水平的优势菌群。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.F007图7肠道微生物在属水平上的分度图Fig.7Genus level of microecological additivesXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.F008图8微生态添加剂肠道微生物在属水平上的热图Fig.8Genus level of heat map microorganisms由表7可知，微生态制剂对蛋鸡肠道微生物结构菌群有显著变化影响的菌属有拟杆菌属、不动杆菌属以及未分类的紫单胞菌贺丛毛单胞菌属（P0.05）。此外还有很多分类位置未定（19.45%~16.31%）和目前数据库里没有信息的菌属（24.17%~21.35%），说明微生态制剂对蛋鸡肠道内微生物菌群的影响还有待深入研究。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.010.T007表7微生态添加剂对肠道微生物群落属水平上丰度的影响Tab.7Effect of microecological additives on the abundance of intestinal microbial community at the level of genera项目M组Z组Firmicutes16.29±1.33a9.01±0.94bBlautia7.82±0.678.19±1.11拟杆菌属（Bacteroides）6.21±0.72a4.87±0.55b不动杆菌属（Acinetobacter）6.50±0.50a6.64±0.69b未分类的紫单胞菌2.64±0.15a5.43±0.60b丛毛单胞菌属（Chloroflexi）3.87±0.29a6.45±0.69b丁酸弧菌属（Anaerostipes）4.14±0.574.01±0.46假单胞菌属（Pseudomonas）2.82±0.292.53±0.23其他21.35±1.5324.17±1.98%3讨论3.1微生态添加剂对蛋鸡肠道菌群在门水平上的影响肠道微生物对蛋鸡起着重要作用[7]。本研究通过对不同组的肠道食糜微生物进行测序分析，发现厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、疣微菌门和放线菌门是蛋鸡肠道微生物群落在门水平上所含的细菌，与王伟唯[8]对蛋鸡肠道功能的测序结果和徐家付[9]的研究中的检测结果存在差异。王伟唯[8]研究发现，在门水平上组成盲肠微生物有厚壁菌门（32.45%~47.86%）、变形菌门（3.28%~17.56%）、拟杆菌门（38.93%~12.54%）、疣微菌门（3.22%~1.04%）和未分类菌门（19.45%~28.37%）。徐家付[9]研究发现，在门水平上主要由厚壁菌门（51.06%~78.21%）、变形菌门（30.29%~49.32%）和疣微菌门（1.59%~18.75%）组成；对比这些数据在某些菌门丰度上有些许不同。此结果可能是由于不同地区的样本在个体微生物上存在差异；不同品种和日龄的蛋鸡也会出现这种差异[10]。3.2微生态添加剂对蛋鸡肠道菌群在科和属水平上的影响在科和属水平上，未知菌群的丰度最高可达19.45%和24.17%，表明当前对蛋鸡肠道微生物的研究还有待深入探讨，很多细分的菌群还未被添加到数据库中。在科和属水平上毛螺旋菌科和瘤胃菌科的丰度很高，且在整个添加微生态制剂的试验中，在蛋鸡肠道中基本保持恒定，与罗利龙[11]、石水琴[12]和刑爽[13]相关研究的数据基本相同。从菌群的门、科、属丰度热图聚类分析结果可知，蛋鸡肠道内微生物群落结构的变化会随着添加微生态制剂而变化，这与摄入的食物有关[14]。Alpha多样性分析表明，随着添加微生态制剂蛋鸡肠道微生物多样性会发生变化，但各种微生物之间无显著差异，说明在给蛋鸡添加微生态制剂的时候，蛋鸡肠道微生物已经完成定植[15]，但会随着摄入食物发生改变[16]，与徐家付[9]的报道一致；但与杨梅梅[17]报道的肠道微生物群落多样性随着蛋鸡肠道微生物结构菌群添加微生态制剂趋于复杂的结果不一致。本研究揭示了微生态添加剂对蛋鸡肠道菌群在门、科、属水平上的丰度情况，能够为蛋鸡肠道疾病的防治和微生态制剂的开发提供参考。4结论在本试验条件下，添加微生态制剂能够提高肠道微生物的丰度，使梭菌族细菌丰度增加，不但可以更多地将有机化合物转化成机体必需的丙酸、乙酸和微量的丁酸，促进鸡的生长发育，增加体重；还可以预防鸡感染沙门氏菌，促进蛋鸡健康生长。