随着养羊业高密度、集约化发展，加之规模化羊场饲养管理不当，往往会同时感染多种病原，造成误诊、滥用药物和防治困难，导致羊群高致病率和高死亡率。近年来，放线菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌均能引起牛羊和其他家畜的非接触传染的慢性病，其中动物感染金黄色葡萄球菌与粪肠球菌较为常见，给养殖业带来严重的经济损失。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）属于革兰氏阳性菌中的葡萄球菌属（Staphylococcus），在自然界中广泛存在，是常见的人畜共患病原[1]，可引起动物肺炎、败血症、心肌炎、脑膜炎等急性感染病和肠炎等慢性感染病[2]。粪链球菌（Streptococcus faecalis）又称粪肠球菌，也属于条件致病菌[3]，呈椭圆形、成对或短链排列、菌落表面光滑，为兼性厌氧的革兰阳性球菌，生存能力较强，在10~45 ℃的温度范围内可以正常生长。研究发现粪肠球菌是肠球菌属中最常见的病原体，具有较强的致病性，继链球菌和葡萄球菌之后的重要感染病原菌[4-6]。这种病原体会引起各种相关传染病，如尿路感染、皮肤软组织感染、伤口感染、菌血症、脑膜炎等[7]。新疆南疆某规模化羊场在2020年9月出现羔羊陆续发病的情况，在15 d之内死亡8只，此后发病不断。临床症状表现为：初期体温高达41~42 ℃、消瘦、精神沉郁、食欲减少、呼吸困难。肺脏呈弥漫性充血、出血、外观呈大理石样；胆囊肿大至原来的2~4倍。本次试验对新疆喀什地区某羊场发病死亡羔羊组织病料中分离出的2株病原菌进行分离鉴定、分子生物学鉴定，明确了病原菌的药物敏感性等生物学特性，确诊此次羔羊发病为金黄色葡萄球菌和粪肠球菌混合感染所致，将为该病的诊断、治疗和防治提供参考。1材料与方法1.1病料采集2020年9月，在南疆喀什地区规模化羊场无菌采集8只病死羔羊的肺脏、脾脏、胆囊等组织，将采集的病料分别装入离心管，存于-80 ℃冰箱，备用。1.2试验动物10周龄健康小鼠6只，体重为20~22 g，由塔里木大学动物实验站提供。1.3试验试剂细菌基因组提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；PremixT aq酶（ExTaq2.0Plus）、DL2000 DNA Marker，均购自TaKaRa公司；BHI液体培养基、LB培养基、MH培养基，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；药敏片购自杭州微生物试剂有限公司。1.4试验方法1.4.1细菌分离培养病料采用无菌采集的方法，切成约1 cm3的组织块，进行涂片、革兰染色；再将病料置于BHL肉汤培养基中，同时分别将组织病料涂布于LB固体培养基、BHI固体培养基和鲜血培养基中，37 ℃培养18~24 h；多个单菌落被挑取之后进行革兰氏染色、瑞氏染色，镜检观察。1.4.2引物的合成运用细菌通用引物扩增金黄色葡萄球菌和粪肠球菌16S rDNA全长序列，16S rDNA基因扩增引物序列及预计扩增长度见表1。引物序列由上海生物工程有限公司合成。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.014.T001表116S rDNA基因扩增引物序列及预计扩增长度Tab.116S rDNA gene amplification sequence and expected amplification length引物引物序列（5′→3′）预计扩增片段/bp上游5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3′1 500下游5′-CGGTTACCTTGTTTACGACTT-3′1.4.3目的基因的扩增采用细菌通用的16S rDNA引物进行菌株基因片段扩增，对扩增出与目的条带相符的部分PCR产物，反应体系为：DNA模板1 μL、2× PCR MIX 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL，振荡混匀。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34个循环，72 ℃再延伸10 min。同时，以ddH2O代替模板DNA作为空白对照。反应结束后，扩增产物在1%琼脂糖凝胶中，以1×TAE缓冲液电泳，观察目的条带，记录阳性鉴定结果并拍照保存，进行测序以及分析。1.4.4动物致病性试验选取6只小白鼠随机分为对照组、试验组和攻毒试验组。分离后挑取单菌落，接种到BHI培养液中，制备成细菌悬液，攻毒试验组每只小鼠腹腔注射0.5×108 CFU细菌悬液，0.2 mL/只，对照组注射同剂量的生理盐水，对死亡的小鼠进行解剖，再将无菌采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等病料做病原的分离与鉴定。1.4.5药敏试验选择氨苄西林、氯霉素、苯唑西林、氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、诺氟沙星、四环素、多西环素、多黏菌素B、万古霉素等临床常用的抗生素，将纯培养物接种在MH培养基上，使用高压过后的棉签涂布均匀，将药敏片以“花瓣状”贴于MH培养基内，37 ℃恒温箱中培养16~18 h，观察并测量抑菌圈的大小。2结果与分析2.1细菌分离培养结果（见图1~图6）将细菌接种在4种不同的培养基上。由图1~图4可知，LB培养基上生长不良；BHI肉汤培养基中出现轻度混浊，形成颗粒状沉淀；BHI固体培养基上生长良好，形态为饱满圆润、表面光滑、边缘整齐、半透明的圆形菌落；鲜血培养基上表现为圆形，周围完全透明的草绿色溶血环。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.014.F001图1LB固体培养基Fig.1LB solid mediumXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.014.F002图2BHI液体培养基Fig 2BHI liquid mediumXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.014.F003图3鲜血培养基Fig.3Blood culture mediumXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.014.F004图4BHI培养基Fig.4BHI medium由图5、图6可知，挑取单个菌落，进行革兰、瑞氏染色，镜检可见有蓝紫色圆形、卵圆形葡萄状的金黄色葡萄球菌；椭圆形或圆形链状排列的粪肠球菌。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.014.F005图5金黄色葡萄球菌革兰染色镜检（10×100）Fig 5Gram staining microscopic examination of Staphylococcus aureus (10×100)XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.014.F006图6粪肠球菌瑞氏染色镜检（10×100）Fig.6Swiss staining microscopic examination of Enterococcus faecalis (10×100)2.216S rRNA PCR扩增结果（见图7）由图7可知，对初步分离的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌进行PCR扩增，电泳结果显示目的片段为1 500 bp，与预期大小一致。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.014.F007图716S rRNAPCR扩增结果Fig.716S rRNA PCR amplification results注 ： M为DL2 000 Marker；1~3为金黄色葡萄球菌；4~6为粪肠球菌；N为阴性对照。2.316S rRNA基因序列分析在NCBI数据库进行中同源性对比，结果表明，一株为金黄色葡萄球菌（登录号为CP-0321601.1），同源性99.93%；另一株为粪肠球菌（登录号为JN-560903.1），同源性为99.72%，这两株菌同源性均高于99%，符合判定标准。2.4动物试验结果（见图8）注射生理盐水的两只小鼠表现为良好的精神状态，对照组的小鼠器官均正常，未发生病理变化。注射细菌悬液的2只小鼠在12~48 h内相继全部死亡，立即将死亡的小鼠剖解。由图8可知，与对照组相比，试验组小鼠心脏有出血点，肝脏肿胀、发黑，脾脏肿大、软、紫、红色，肺脏充血、出血，肾脏质脆、变软、出血。分别取2只小鼠组织进行病原的分离与鉴定及革兰染色，可见一种为蓝紫色圆形葡萄状的球菌；另一种为椭圆形或圆形链状排列的球菌，说明这两种病原菌具有一定毒力，能够致小白鼠死亡。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.014.F008图8动物试验解剖Fig.8Anatomy of animal experiment2.5药敏试验结果（见表3）XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.08.014.T002表3药敏试验结果Tab.3Results of drug sensitivity test项目纸片含量/(µg/片)金黄色葡萄球菌粪肠球菌敏感性抑菌圈直径/mm敏感性抑菌圈直径/mm氨苄西林10R20S20氯霉素10R8R8苯唑西林10R16I16氨苄西林15R6R6庆大霉素10R6R6卡那霉素10S21S21红霉素10S20S20诺氟沙星15S22S22四环素30S27S27多西环素10R22S31多黏菌素B30R18S18万古霉素10R20S20注 ：S为敏感，I为中介，R为耐药。由表３可知，金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素氨苄西林、氨苄西林、氯霉素、苯唑西林产生耐药性；对氨基糖苷类抗生素庆大霉素、卡那霉素产生耐药性；对大环内酯类抗生素红霉素表现为高度敏感；对多肽类抗生素多黏菌素Ｂ和万古霉素产生耐药性；对喹诺酮类抗生素诺氟沙星表现为高度敏感；对四环素类抗生素四环素、多西环素等产生耐药性。粪肠球菌对β-内酰胺类抗生素氨苄西林高度敏感；对氯霉素、氨苄西林耐药；对氨基糖苷类抗生素庆大霉素、卡那霉素耐药；对大环内酯类抗生素红霉素高度敏感；对多肽类抗生素多黏菌素Ｂ和万古霉素敏感；对喹诺酮类抗生素诺氟沙星高度敏感，对四环素类抗生素四环素、多西环素等药物高度敏感，临床用药时可交替使用以上敏感药物，可达到有效治疗的目的。3讨论无菌采集病死羔羊肝脏、肺脏、脾脏等器官组织接种于不同培养基中，发现2种致病菌，经分离培养、药敏试验、动物试验、16S rRNA基因序列分析，结果判定2种致病菌分别为金黄色葡萄球菌与粪肠球菌，表明本次引起该规模化羊场羔羊死亡的主要病原菌为金黄色葡萄球菌与粪肠球菌。关于动物感染粪肠球菌的报道很多，但与金黄色葡萄球菌混合感染的报道较少[8]，主要是由于对此情况关注度不够高。王亚宾等[9]发现，由粪肠球菌可引起仔猪关节炎，但对致病机理有待进一步研究。齐亚银等[10]从羔羊中分离鉴定出羔羊脑炎型粪肠球菌，发现由于是机会感染菌，其感染途径可能与温度、气候有关。陈一资等[11]分析了某鸭场暴发的粪肠球菌病，结果显示，养殖场的环境、饲养条件给粪肠球菌提供了生长环境，导致疫病暴发。范辉[12]从雏鸡中分离到1株致病性粪肠球菌。金黄色葡萄球菌与粪肠球菌都是环境中广泛存在的条件致病菌[13]，羊场中发病羊为20~30日龄的羔羊，抵抗力较低，同时夏季是细菌性疾病多发的季节，当两种条件致病菌混合感染后，环境出现变化时，条件致病菌就有机会出动，对羊体造成影响从而发病。本试验中的规模化羊场环境良好，可以排除环境因素，推测由于是机会感染菌，感染途径可能与气候、温度、营养、生殖器官的感染有关；另外也与临床上滥用抗生素有关，其发病的机理有待一步研究。本次药敏试验中，两种菌均敏感的药物是卡那霉素、红霉素、四环素和诺氟沙星，但混合感染一般不能提前用药预防，尤其是环境出现骤变时难以预防，在此类混合感染的临床治疗中，应合理使用药物，严禁滥用抗生素，应防止多药耐药菌株的出现和流行，并应加强监督和控制。本试验表明，喀什地区部分规模化羊场预防措施效果不理想，有金黄色葡萄球菌与粪肠球菌的感染情况，还需要加强饲养管理和疾病预防工作。针对羊场的现状，建议采取防控措施：在引入动物时，必须进行检验和隔离观察，确认羊健康，才能将混群饲养；加强饲养管理，采取防风防冻的措施，增强动物自身的抵抗力，也是预防这种疾病的重要举措[14]；对未发病的动物可以用抗生素做预防性治疗，或用疫苗进行紧急接种；此外，提高饲养人员技术水平是关键，增强饲养人员防控意识，通过进行理论知识的培训从而提高科学饲养的技术水平，对治疗疾病的技术进行学习培养，可以为疾病的早期发现和治疗提供基本保证[15]。4结论本试验分离鉴定出金黄色葡萄球菌与粪肠球菌，发现该羊场发病羊为2种病原菌混合感染，对其进行药敏试验及毒力试验，对本病提供可行性的防控措施。