桂皮(cinnamon)又称官桂或香桂,是肉桂和天竺桂等树皮的统称,具有特殊香气[1],主产于广西、云南和福建等地[2-3]。酚类化合物广泛存在于天然植物中,是一种天然、绿色、安全的生物抗氧化剂,也是桂皮中主要活性成分之一,对畜禽机体抗炎、抗应激和抗氧化均有显著作用。在饲料中添加酚类化合物能够缓解仔猪腹泻,缓解大肠杆菌对机体的损伤,提高动物自身的抗氧化能力和免疫力,具有安全性高、毒副作用小和抗氧化活性高等优点,可提高饲料利用效率,对动物生产具有积极影响[4-5]。超声波辅助提取法,可促进植物体中有效成分的溶解,具有提取效率高、提取时间短以及操作简便等优点[6-7]。提取过程中加入纤维素酶可以提高细胞膜和细胞壁的通透性,使细胞内溶物加快溶出,安全易控[8]。Wu等[9]和邢颖等[10]研究表明,超声波辅助纤维素酶法相较于其他方法对多酚及黄酮类提取率较高。有研究人员用水浴浸提法提取桂皮总酚,并优化提取工艺条件[11-12];但是,采用超声波辅助纤维素酶提取桂皮多酚类物质的研究还鲜有报道。本试验采用超声波辅助纤维素酶法提取桂皮中的酚类成分,通过响应面对提取工艺进行优化,确定最佳工艺条件,并通过桂皮总酚对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除效果来判断其体外抗氧化能力,为将桂皮总酚进一步开发应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料广西桂皮购自锦州市大润发超市;纤维素酶(30 000 U/g)、没食子酸标准品,购自上海惠世生化试剂有限公司;葡萄糖、抗坏血酸(VC)、无水乙醇、碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过硫酸钾、福林酚试剂,均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基(DPPH)、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)购自上海如吉生物科技有限公司。1.2仪器设备UV-5100B紫外分光光度仪购自上海元析仪器有限公司;FZ102型微型植物粉碎机购自天津市泰斯特仪器有限公司;HH-S2型电热恒温水浴锅购自金坛市良友仪器有限公司;电子分析天平购自北京奥多利斯天平有限公司;KH-500V型超声波清洗器购自昆山禾创超声仪器有限公司;GL20M高速冷冻离心机购自湖南凯达科学仪器有限公司。1.3试验方法1.3.1桂皮提取液的制备将低温烘干的桂皮用固体粉碎机粉碎后,过100目筛,得到桂皮粉末。精确称量1.0 g桂皮粉末加入适量的纤维素酶溶解于体积浓度为60%的乙醇溶液中,调节pH值至5.0,将液体样品放入超声波清洗器中超声处理;提取液以5 000 r/min离心10 min后,抽滤,滤渣以相同条件再次提取,过滤,合并滤液,取上清液待用。1.3.2没食子酸标准曲线的绘制以没食子酸为对照标准,根据李红玉等[11]方法稍做修改。取没食子酸标准品配制成质量浓度为0.1 g/L的对照品储备液。分别吸取上述储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,置于6个25 mL棕色容量瓶中,加入6 mL蒸馏水,Folin-Ciocalteu显色剂1 mL,摇匀,6 min后再加入3 mL 20%碳酸钠溶液,混匀并定容至刻度线,避光反应40 min;同时用蒸馏水做空白,于波长765 nm处测得吸光度。分别以吸光度值和没食子酸浓度为横、纵坐标,3次平行试验取平均值,绘制标准曲线,见图1。得到回归方程:Y=0.387 1X+0.013 6,R2=0.998 1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F001图1没食子酸标准曲线1.3.3桂皮总酚得率的计算采用Folin-Ciocalteu比色法。吸取不同浓度的提取液0.1 mL,按照标准曲线建立的方法,测定吸光度值,代入标准曲线方程,求出桂皮总酚得率[13]。桂皮总酚得率=CV/M×100%(1)式中:C为根据标准曲线方程计算出待测液中多酚的质量浓度(g/L);V为提取样品体积(mL);M为样品质量(g)。1.3.4单因素试验设计1.3.4.1纤维素酶添加量对桂皮总酚得率的影响称取5份粉碎干燥的桂皮试样,按料液比1∶60(g/mL)加入体积浓度为60%的乙醇溶液,分别添加6、12、18、24、30 U/mL纤维素酶,酶解温度为50 ℃,酶解时间为60 min,超声波清洗器提取功率为200 W的条件,考察不同纤维素酶添加量对桂皮总酚得率的影响。1.3.4.2酶解温度对桂皮总酚得率的影响称取5份粉碎干燥的桂皮试样,按料液比1∶60(g/mL)加入体积浓度为60%的乙醇溶液,纤维素酶添加量为18 U/mL,分别在30、40、50、60、70 ℃温度下进行酶解,酶解时间为60 min,在超声波清洗器提取,提取功率为200 W,考察不同酶解温度对桂皮总酚得率的影响。1.3.4.3酶解时间对桂皮总酚得率的影响称取5份粉碎干燥的桂皮试样,按料液比1∶60(g/mL)加入体积浓度为60%的乙醇溶液,纤维素酶添加量为18 U/mL,酶解温度为50 ℃,分别酶解20、40、60、80、100 min,在超声波清洗器中提取,提取功率为200 W,考察不同酶解时间对桂皮总酚得率的影响。1.3.4.4超声功率对桂皮总酚得率的影响称取5份粉碎干燥的桂皮试样,按料液比1∶60(g/mL)加入体积浓度为60%的乙醇溶液,纤维素酶添加量为18 U/mL, 酶解温度为50 ℃,酶解时间为60 min,分别在功率为100、150、200、250、300 W超声波清洗器中提取,考察不同超声功率对桂皮总酚得率的影响。1.3.5响应面优化试验设计在单因素试验基础上,利用Design-Expert 11软件的Box-Behnken中心组合试验设计原理进行响应面试验[14-16]。选取纤维素酶添加量、酶解温度、酶解时间和超声功率4个因素作为自变量,并分别选取低、中、高3个水平得到4因素3水平的因素水平表,响应面因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.T001表1响应面因素水平设计水平A纤维素酶添加量/(U/mL)B酶解温度/℃C酶解时间/minD超声功率/W-1124040150018506020012460802501.3.6桂皮总酚体外抗氧化活性的测定1.3.6.1DPPH自由基清除能力参照陈永平等[17]方法稍做改动,配制浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液,置于棕色容量瓶中避光保存备用,将桂皮总酚粗提液配制成质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L的待测液,分别吸取1 mL不同浓度待测液于3 mL DPPH溶液中,混匀,室温暗处放置30 min充分反应,在517 nm波长处测得吸光度值为A1;用等体积无水乙醇替换DPPH溶液,同法操作,测得吸光值为A2;用等体积蒸馏水代替桂皮总酚粗提液,同法操作,测得吸光度值为A0。用等浓度VC作为阳性对照组,3次平行试验。计算公式为:DPPH自由基清除率=(1-A1-A2A0)×100%(2)1.3.6.2ABTS+自由基清除能力参照Ewelina等[18]的测定方法稍做修改。吸取5 mL ABTS+自由基(7 mmol/L)溶液与5 mL过硫酸钾(2.45 mmol/L)溶液混匀后避光反应12 h,得到ABTS+自由基工作液,使用前用磷酸缓冲盐溶液稀释,要求734 nm波长处吸光度为0.70。将桂皮总酚粗提液配制成质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L的待测液,将3 mL ABTS+自由基工作液分别与0.4 mL不同浓度待测液混匀,室温下暗处放置6 min后在734 nm波长处测得吸光值为A1;将ABTS+自由基工作液替换成等体积磷酸缓冲盐溶液测得吸光值为A2;将样品溶液替换成等体积的蒸馏水测得吸光度值为A0。用等浓度的VC作为阳性对照组,3次平行试验。计算公式为:ABTS+自由基清除率=(1-A1-A2A0)×100%(3)1.4数据统计与分析采用Excel软件整理数据及制表绘图,数据均为3次平行试验,结果以“平均值±标准差”表示,采用DesignExpert 11统计软件进行响应面优化分析。2结果与分析2.1单因素试验结果分析2.1.1纤维素酶添加量对桂皮总酚得率的影响(见图2)由图2可知,随着纤维素酶用量的增加,桂皮总酚得率也逐渐上升,添加量达到18 U/mL时,桂皮总酚得率最大,为3.7%。继续增加酶用量,桂皮总酚得率不再增加,可能是当纤维素酶添加量达到一定量时,底物已经处于酶饱和状态[19],桂皮总酚得率趋于平缓。因此,纤维素酶最适宜添加量为18 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F002图2纤维素酶添加量对桂皮总酚得率的影响2.1.2酶解温度对桂皮总酚得率的影响(见图3)由图3可知,桂皮总酚得率随提取温度的升高呈先上升后下降趋势。酶解温度在50 ℃之前,桂皮总酚得率随着温度升高而逐渐提高,温度在50 ℃时总酚得率达到最大值,为3.63%,当温度超过50 ℃后,得率下降。分析原因可能是高温使纤维素酶部分或全部变性,酶活性减弱,酶促反应受到抑制,使多酚物质的浸提受到影响。因此,选择最适宜酶解温度为50℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F003图3酶解温度对桂皮总酚得率的影响2.1.3酶解时间对桂皮总酚得率的影响(见图4)由图4可知,随着酶解时间的增加,桂皮总酚得率在20~60 min之间时呈上升的趋势;在60 min时,得率达最大值,为2.8%;在60~100 min时,多酚提取率呈下降趋势。这是由于超声较强的机械效应,短时间内有利于多酚物质的溶出,长时间的超声作用使酚类物质被超声波的剪切力降解[20],破坏桂皮中酚类物质,导致得率下降。因此,选择适宜的酶解时间为60 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F004图4酶解时间对桂皮总酚得率的影响2.1.4超声功率对桂皮总酚得率的影响(见图5)由图5可知,随着超声功率的增加,桂皮总酚得率呈先上升后下降趋势。在功率为200 W时,桂皮总酚得率达到最大值,为3.33%。分析原因可能由于是一定强度的超声功率可以加速酶的反应,随着功率进一步增强会破坏桂皮中的酚类物质[21],导致提取率降低。因此,最适宜的超声功率为200 W。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F005图5超声功率对桂皮总酚得率的影响2.2响应面试验结果分析2.2.1回归模型方差分析(见表2、表3)利用Design-Expert11软件对表2试验数据进行二次多项式回归分析得到桂皮总酚得率(Y)的回归方程:10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.T002表2响应面试验结果试验号A/(U/mL)B/℃C/minD/W总酚得率/%11240602003.1822440602003.5631260602003.1142460602003.4251850401503.3261850801503.5871850402503.2881850802503.4591250601503.12102450601503.68111250602503.24122450602503.48131840402003.54141860402003.32151840802003.7161860802003.32171250402003.22182450402003.46191250802003.24200.850802003.62211840601503.66221860601503.36231840602503.46241860602503.32251850602003.78261850602003.84271850602003.88281850602003.74291850602003.83Y=+3.81+0.18A-0.10B+0.064C-0.041D-0.017AB+0.035AC-0.080AD-0.040BC+0.040BD-0.022CD-0.27A2-0.19B2-0.18C2-0.19D2由表3可知,一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2、D2对桂皮总酚得率影响均为极显著(P0.01),一次项D和交互项AD对桂皮多酚得率影响显著(P0.05),其他交互项对桂皮总酚得率影响均不显著(P0.05),模型P值小于0.000 1,达到极显著水平,总决定系数R2为0.952 2,失拟项P值0.281 50.05,影响不显著,说明回归方程的拟合情况良好[22-23]。对回归方程进行检验,模型的校正决定系数RAdj2为0.904 3,说明此模型能解释90.43%响应值的变化,可用该方程进行试验分析。因此,纤维素酶提取桂皮总酚的工艺参数中,对桂皮总酚得率影响的主次因素顺序为:纤维素酶添加量酶解温度酶解时间超声功率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.T003表3响应面试验回归模型方差分析变异来源平方和自由度均方F值P值显著性模型1.360140.09719.900.000 1极显著A0.37010.37075.920.000 1极显著B0.13010.13026.640.000 1极显著C0.04910.04910.110.006 7极显著D0.02010.0204.090.062 6显著AB1.225×10-311.225×10-30.250.624 4AC4.900×10-314.900×10-31.000.333 7AD0.02610.0265.240.038 2显著BC6.400×10-316.400×10-31.310.271 7BD6.400×10-316.400×10-31.310.271 7CD2.025×10-312.025×10-30.410.530 2A20.46010.46094.910.000 1极显著B20.23010.23047.870.000 1极显著C20.20010.20041.780.000 1极显著D20.23010.23047.870.000 1极显著残差0.068144.887×10-3失拟项0.056105.650×10-31.900.281 5不显著净误差0.01242.980×10-3总离差1.43028R20.952 2RAdj20.904 3注:P0.01表示极显著,P0.05表示显著,P0.05表示不显著。2.2.2响应面分析(见图6)一般响应面越陡峭,说明两因素对响应值的交互作用越显著[24-26]。由图6(a)可知,当纤维素酶添加量一定时,桂皮总酚得率随着超声功率增加呈现先增大后减小的趋势。图中等高线接近椭圆形,可知超声功率与纤维素酶添加量交互作用对响应值的影响显著,与回归方程方差分析的结果相符。图6(b)~6(f)曲面图比较平缓,等高线接近圆形,说明酶解温度和酶解时间、酶解温度和超声功率、纤维素酶添加量和酶解温度、纤维素酶添加量和酶解时间、酶解时间和超声功率之间交互作用不显著。图6各因素交互作用对桂皮总酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F6a1(a)超声功率及纤维素酶添加量对桂皮总酚得率交互作用的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F6a2(b)酶解时间及酶解温度对桂皮总酚得率交互作用的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F6a3(c)超声功率及酶解温度对桂皮总酚得率交互作用的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F6a4(d)酶解温度及纤维素酶添加量对桂皮总酚得率交互作用的10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F6a5(e)酶解时间及纤维素酶添加量对桂皮总酚得率交互作用的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F6a6(f)超声功率及酶解时间对桂皮总酚得率交互作用的2.2.3最佳工艺条件的验证桂皮多酚最佳提取条件为:纤维素酶添加量24 U/mL、酶解温度46.04 ℃、酶解时间66.98 min、超声功率180.95 W。在此条件下,桂皮多酚得率可达到3.787%。为试验操作方便,稍做调整后的最佳工艺条件为:纤维素酶添加量24 U/mL、酶解温度45 ℃、酶解时间65 min、超声功率180 W。在此工艺条件下进行3次平行试验,获得的桂皮总酚得率3.84%,与预测值无显著差异。2.3桂皮总酚体外抗氧化活性试验结果2.3.1桂皮总酚对DPPH自由基的清除能力(见图7)由图7可知,DPPH自由基清除率与总酚含量呈线性正相关,随着质量浓度的增大,桂皮总酚和VC对DPPH的清除率均先增大后趋于平缓。当浓度达到0.1 g/L时,桂皮总酚的清除率为82.33%。此时,桂皮总酚对DPPH自由基有较好的清除效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F007图7不同浓度桂皮总酚对DPPH自由基的清除率2.3.2桂皮总酚对ABTS+自由基的清除能力(见图8)由图8可知,ABTS+自由基清除能力随着质量浓度的增大而升高,质量浓度达到0.1 g/L时,桂皮总酚对ABTS+自由基的清除率达到85.67%。此时,桂皮总酚对ABTS+自由基有较好的清除效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.019.F008图8不同浓度桂皮总酚对ABTS+自由基的清除率3结论试验采用单因素试验和响应面对超声波辅助纤维素酶提取桂皮中总酚的工艺条件进行优化,所得回归模型能较好地预测桂皮总酚得率,得到的最佳工艺条件为:纤维素酶添加量24 U/mL、酶解温度45 ℃、酶解时间65 min、超声功率180 W。在此工艺条件下测得桂皮总酚得率为3.84%,与理论预测值相近,说明本试验建立的模型有效且准确性好,优化方案合理。该提取方法耗能低、提取速度较快,为桂皮总酚高效提取提供参考。体外抗氧化活性研究表明,当桂皮总酚溶液浓度为0.1 g/L时,对DPPH和ABTS+自由基的清除率均可达到80%以上,具有较强的抗氧化能力。
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