我国玉米秸秆产量大，年产量超6亿t，约占世界秸秆总量的25%。目前，秸秆的处理方式多为焚烧或还田，仅有少量用于造纸等行业，会引起环境污染，造成秸秆资源浪费，破坏土壤营养结构[1]。玉米秸秆普遍存在粗蛋白含量低、粗纤维含量高、适口性差和消化率低的特点[2]。普通的物理粉碎不能释放营养成分，因此玉米秸秆营养利用率低[3]。菌酶协同发酵技术可以提高玉米秸秆的饲用价值[4]。将发酵菌剂和外源酶制剂加入制作好的全混合日粮（TMR）中可以有效改善饲粮的适口性，提高日粮利用率，缓解能量负平衡，确保动物有较高的采食量和生产性能。本试验研究不同含水率和酶制剂对以玉米秸秆为主要纤维来源的发酵全混合日粮发酵品质的影响，旨在确定发酵玉米秸秆时的最适宜含水率和最佳酶制剂，为FTMR的生产提供参考。1材料与方法1.1试验方法1.1.1FTMR的制作试验粗饲料选用揉丝玉米秸秆，初水分为11.09%，精料初水分为10.41%，按照精粗比4∶6（干物质基础）混合均匀。将33.4 g乳酸菌菌剂和增菌剂加入活化罐中，加入10 kg水，37 ℃恒温发酵箱中活化12 h。将活化好的乳酸菌菌液与33.4 g酵母菌混合，均匀喷洒至混合料中。将混合料分为4等份，分别加入41.75 g复合酶A、B和8.35 g复合酶C、D，混合均匀，将每等份的混合料均匀分为3小份与额外添加的水混合均匀，保证制得FTMR的含水率分别为45%、55%、65%（将活化菌液水考虑在内）。按不同含水率不同酶制剂的分组方式利用呼吸样品袋分装，每组样品3个重复，共分装36包，做好标记，压实，排空内部气体后热合封口置33 ℃恒温发酵车间。TMR组成及营养水平见表1。菌剂和酶制剂的添加比例和添加量见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.022.T001表1TMR组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00揉丝玉米秸秆60.00总能/(MJ/kg)12.97玉米18.20干物质/%88.60豆粕5.80粗蛋白/%12.85小麦麸8.00粗脂肪/%4.20花生壳颗粒3.00粗灰分/%6.98DDGS3.00钙/%0.92石粉0.40总磷/%0.67盐0.30有效磷/%0.41磷酸氢钙0.30预混料1.00注：1.预混料购自辽宁九州生物科技有限公司。2.营养水平中总能为计算值，其余均为实测值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.022.T002表2菌剂和酶制剂的添加比例和添加量菌剂/酶制剂添加比例/(g/t)（TMR风干状态）添加量/g乳酸菌1 00033.40增菌剂1 00033.40酵母菌1 00033.40酶制剂A5 00041.75酶制剂B5 00041.75酶制剂C1 0008.35酶制剂D1 0008.35注：菌剂和酶制剂均购自辽宁九州生物科技有限公司。1.1.2样品采集FTMR发酵5 d，每包样品混合均匀。取鲜样进行感官鉴定及总酸、pH值和微生物指标的检测。四分法取样约500 g于65 ℃烘箱内烘干至恒重，测定初水分，粉碎过40目筛，制成粉干样品用于常规指标的检测。1.2测定指标及方法1.2.1常规营养成分参照杨胜[5]的方法测定营养成分含量。应用凯氏定氮法测定样品中粗蛋白（CP）含量；采用范氏纤维测定法测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量；酸性洗涤纤维测定后的滤袋经72%硫酸浸泡和灼烧后，测定木质素（ADL）含量。1.2.2发酵指标使用pH S-25精密pH计（上海仪电科学仪器有限公司）测定pH值[5]。总酸的测定：称取试样10 g（准确到0.02 g）于250 mL三角瓶中，加入190 mL、60 ℃蒸馏水，提取30 min，过滤，取40 mL上清液，加入2~3滴酚酞指示剂，使用标准氢氧化钠溶液滴定到终点，溶液由无色变为红色，30秒不褪色。使用Biosensors Analyzer S-10生物传感器分析仪（深圳市西尔曼科技有限公司）测定乳酸、葡萄糖、乙醇含量。1.2.3微生物指标称取FTMR 20 g放入无菌拍打式均质袋内，加180 mL灭菌的生理盐水，混合均匀，抽取1 mL菌液10倍比稀释到1×10-8。乳酸菌数量的测定采用MRS平板计数法；芽孢杆菌数量测定采用营养琼脂平皿涂布法[6]；酵母菌数量的测定采用孟加拉红培养基平板计数法；大肠杆菌数量的测定采用结晶紫中性红胆盐琼脂双层倾倒板法。1.2.4感官指标感官指标参考青贮品质鉴定方法[7]。从不同水分酶制剂FTMR的颜色、气味和黏度3个方面进行评测，初步判定FTMR发酵的效果。1.3数据统计与分析数据采用SPSS 20.0软件进行双因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同含水率和酶制剂对FTMR常规营养成分的影响（见表3）由表3可知，各试验组的CP含量随着发酵含水率的增加呈上升趋势，与0 d未发酵组相比，55%含水率酶制剂B、C、D组和65%含水率各组的CP含量显著升高（P0.05），其中65%含水率酶制剂B组的CP含量最高，为11.87%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.022.T003表3不同含水率和酶制剂对FTMR常规营养成分的影响项目酶制剂CP/(% DM)NDF/(% DM)ADF/(% DM)ADL/(% DM)0 d未发酵组10.06±0c59.27±0a33.18±03.22±0abc45%含水率A10.31±0.77bc57.52±3.51ab32.53±3.542.96±0.39bcdB10.27±0.47bc54.93±1.52b31.09±0.833.36±0.35abC10.44±0.10bc59.16±1.66a33.83±1.143.58±0.16aD10.38±0.06bc60.39±3.23a33.27±1.913.42±0.07a55%含水率A10.53±0.13bc59.89±0.79a34.04±0.263.34±0.20abB10.77±0.73ab57.52±0.80ab32.02±0.113.36±0.08abC10.91±0.51ab60.50±4.06a33.72±2.543.35±0.16abD10.85±0.27ab59.88±0.79a33.20±0.272.91±0.11cd65%含水率A11.49±1.31a57.36±2.97ab32.06±1.582.42±0.47dB11.87±0.77a56.45±1.98ab32.49±1.283.37±0.08abC11.06±0.62ab58.40±1.79ab33.13±0.982.96±0.11bcdD11.67±0.69a57.32±0.75ab32.42±0.503.49±0.23aP值酶制剂0.7730.0250.1520.291水分0.0360.0790.4830.059酶制剂×水分0.0580.7030.7360.000注：同列数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2不同含水率和酶制剂对以玉米秸秆为主的FTMR发酵过程中发酵指标的影响（见表4）由表4可知，与0 d未发酵组相比，酶制剂组pH值均显著降低（P0.05），乳酸和乙醇含量显著升高（P0.05）。试验组65%含水率酶制剂A组pH值最低，为3.84；65%含水率酶制剂B组的总酸含量最高，为8.80%，是0 d未发酵组总酸含量的3.2倍；与含水率45%相比，含水率55%和65%酶制剂A和酶制剂B组的总酸含量显著升高（P0.05）；65%含水率酶制剂B组的乳酸含量最高，为5.01%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.022.T004表4不同含水率和酶制剂对FTMR发酵指标的影响项目酶制剂pH值总酸/(% DM)乳酸/(% DM)葡萄糖/(% DM)乙醇/(% DM)0 d未发酵组5.38±0.04a2.75±0.14f0.53±0.07f2.18±0.07ab0.90±0.04b45%含水率A4.22±0.06cd4.78±1.13de2.35±0.57cde1.61±0.38bc4.13±0.79aB4.34±0.24bc4.90±0.59de1.97±0.41e1.62±0.37bc4.45±0.42aC4.27±0.13bcd3.05±0.79f1.71±0.62e0.61±0.07de3.91±1.20aD4.42±0.14b2.98±1.30f1.55±0.44e0.42±0.06e3.43±1.84a55%含水率A4.02±0.05ef6.78±1.43bc3.08±0.77bcd1.59±0.33bc3.99±0.55aB4.01±0.05ef7.17±1.49abc3.46±0.71bc1.64±0.56bc4.50±0.97aC4.11±0.04de4.87±0.53de2.30±0.27de0.72±0.12de4.21±2.37aD4.23±0.02cd3.32±0.59ef2.36±1.21cde0.79±0.77de3.32±1.94a65%含水率A3.84±0.01g6.82±0.68bc3.64±0.42b2.02±0.22ab4.21±0.50aB3.92±0.03fg8.80±1.00a5.01±0.72a2.40±0.28a5.38±0.90aC4.01±0.09ef7.75±0.97ab3.35±0.43bcd1.07±0.24cd4.82±0.53aD4.27±0.08bcd5.76±0.61cd3.28±0.26bcd0.70±0.15de3.59±0.53aP值酶制剂000.0670.0200.155水分000.0090.0760.230酶制剂×水分0.1740.0410.1640.2110.4602.3不同含水率和酶制剂对FTMR微生物指标的影响（见表5）由表5可知，65%含水率酶制剂A、B组的乳酸菌含量与0 d未发酵组接近。与0 d未发酵组相比，酶制剂组酵母菌含量显著降低（P0.05），65%含水率的酶制剂A和酶制剂B组未检出。芽孢杆菌的数量随着发酵含水率的增加呈先升高后降低。试验组大肠杆菌的含量均未检出。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.022.T005表5不同含水率和酶制剂对FTMR微生物指标的影响项目酶制剂乳酸菌酵母菌芽孢杆菌大肠杆菌0 d未发酵组7.74±0d7.24±0a7.04±0c7.60±045%含水率A8.66±0.47abc5.72±0.58b7.58±0.04bc—B8.88±0.31ab5.99±0.40b8.02±0.07ab—C8.85±0.40ab5.79±0.66b7.82±0.04bc—D9.02±0.11a5.88±0.13b8.00±0.88ab—55%含水率A8.19±0.06bcd—8.19±0.06a—B8.76±0.13ab2.51±3.55c8.45±0.06a—C8.70±0.06ab2.51±3.54c8.21±0.35a—D9.00±0.35a2.75±3.88c8.09±0.32ab—65%含水率A7.99±0.37cd—7.88±0.31bc—B7.99±0.37cd—7.72±1.21bc—C8.59±0.28abc3.63±5.13c7.98±0.86bc—D9.01±0.32a2.66±3.76c8.01±0.02ab—P值酶制剂0.0020.4870.006—水分0.0840.0080.138—酶制剂×水分0.2740.8720.003—注：—表示未检出（2）。lgCFU/g2.4不同含水率和酶制剂对FTMR感官指标的影响（见表6）由表6可知，65%含水率FTMR发酵效果醇香味更浓均优于55%和45%含水率的发酵效果；相同条件下酶制剂A、酶制剂B的颜色更深、气味更浓，并且随着含水率的增加，发酵效果越好。因此初步判断，酶制剂A和酶制剂B的发酵效果优于酶制剂C和酶制剂D。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.022.T006表6不同含水率和酶制剂对FTMR感官指标的影响项目酶制剂颜色气味黏度发酵0 d发酵5 d发酵0 d发酵5 d发酵0 d发酵5 d45%含水率A++++++-++++B++++++-+++++C++++++-++++D++++++-++++55%含水率A++++++++-++++++B++++++++-+++++++C+++++++-+++++D+++++++-+++++65%含水率A+++++++++-++++++B+++++++++-+++++++C+++++++++-++++++D++++++++-+++++注：1.颜色：+为浅黄色；++为黄色；+++为亮黄色；++++为土黄色，+++++为黄褐色；++++++为浅褐色；+++++++为褐色；++++++++为深褐色。2.气味：-为无酸香味；+为弱酸香味；++为酸香味；+++为强酸香味；++++为酸味、弱醇味。3.黏度：+为无黏连；++为有黏连；+++为黏连；++++为强黏连。3讨论3.1不同含水率和酶制剂对FTMR常规营养成分的影响本试验结果表明，与0 d未发酵组相比，发酵组CP含量显著上升，与王晶等[8]的报道结果一致，原因可能是发酵过程中乳酸菌等微生物将饲料中的蛋白质分解成小分子的氨基酸等物质，使蛋白质的数量减少，但饲料中总含氮量没有减少，且微生物和酶制剂分解了玉米秸秆的植物细胞壁，释放了细胞中的蛋白质，造成整体数值升高[9]。各试验组发酵结束后，NDF、ADF和ADL的含量有一定波动，与王加启等[10]的结果相似，原因可能是发酵过程中微生物的分解作用和加入的酶制剂引起纤维素和半纤维素降解，且微生物的产物提高了饲料中的营养物质的相对含量。3.2不同含水率和酶制剂对FTMR发酵指标的影响从乳酸的结果来看，55%和65%的含水率的发酵效果更好一些。总酸度指饲料中所有能释放出H+成分的物质总量，包括有机酸和无机酸，发酵饲料中总酸含量可以从一定程度上反映发酵效果[11]。本试验中，试验组的总酸含量与含水率呈正比，说明含水率越高，饲料中产生的酸性物质越多，更有利于抑制发酵过程中的好氧菌和有害微生物生长，促进乳酸菌等有益发酵菌种的繁殖，加强玉米秸秆植物细胞壁的溶解程度，使营养物质充分释放。与0 d未发酵组相比，试验组葡萄糖含量先降低的原因可能是微生物发酵初期利用饲料中的葡萄糖进行供能产酸。高含水率组葡萄糖数值升高的原因可能是微生物和酶对植物细胞壁的溶解效果较好，细胞中的葡萄糖完全释放出来并且还未来得及被利用。各试验组的乙醇含量相比对照组均有显著升高，其中乙醇含量最高的是65%含水率、酶B组，说明本试验的FTMR在65%含水率、酶制剂B作用下发酵效果最好。3.3不同含水率和酶制剂对FTMR微生物指标的影响本试验中，随着发酵含水率增加，乳酸菌含量迅速升高后又缓慢降低，原因可能是好氧微生物将氧气用完后为乳酸菌创造出适宜的厌氧环境，使乳酸菌迅速大量繁殖，产生大量乳酸，随着发酵程度的减弱，发酵进入稳定期，微生物代谢活动保持稳定，发酵后期过酸的环境也不利于乳酸菌自身的繁殖，因此其数量缓慢降低，与宁婷婷[12]和陈雷[13]的试验结果一致。酵母菌是导致发酵饲料变质的主要微生物[14]，属于兼性厌氧菌，主要利用饲料中的葡萄糖成分，在氧气充足条件下的产物为水和CO2，这解释了发酵过程中的胀包现象。酵母菌在无氧条件下会生成乙醇[15]，因此试验组的乙醇含量会逐渐升高。酵母菌在无氧条件下的生存活动会受到抑制，随着发酵过程pH值降低，过酸的环境不利于生存，导致数量减少[16]，因此乙醇含量的上升速度会逐渐减缓直至稳定。酵母菌数量大于5 lgCFU/g时，饲料易发生腐败变质[17]。本试验中，以55%和65%含水率发酵更有利于FTMR的保存。芽孢杆菌能够耐受高温，在有氧无氧条件下存活。芽孢杆菌可以消耗发酵袋中残留的氧气，为乳酸菌的厌氧发酵创造有利条件[18]。因此，芽孢杆菌在初期氧气较高时增殖明显，随着乳酸产酸增多，pH值降低，活性受到抑制，数量略有降低。普通大肠杆菌在饲料中属于有害菌类，发酵时产生的大量乳酸会对其起到杀灭作用[19]。在芽孢杆菌的发酵过程中会产生一些杀灭有害菌的细菌素（抗菌肽）[20]，因此在FTMR中未检出大肠杆菌。3.4不同含水率和酶制剂对FTMR感官指标的影响FTMR的含水率会直接影响饲料的发酵品质，控制好水分含量才能保证获得良好的发酵物，减少营养物质的损失[21-22]。45%含水量组乳酸菌未大量繁殖，发酵不完全，因此酸味指标比55%和65%组低，颜色发白。本次试验65%含水率组乳酸菌发酵效果更好，酸味更浓。4结论本试验结果表明，以玉米秸秆为纤维来源制作的FTMR的最适宜发酵含水率是65%，最佳的酶制剂为酶B。