自由基是机体新陈代谢时产生的一类含有奇数电子的原子或分子[1]。自由基过多会破坏蛋白质、核酸和生物膜系统，是造成氧化应激的主要因素[2]。正常生理状态下，自由基的产生和清除会保持动态平衡。当自由基的产生量超过机体的清除能力时，会大量蓄积，使机体处于氧化应激状态。奶牛机体代谢旺盛，容易蓄积自由基发生氧化应激，处于热应激状态的奶牛更容易发生氧化应激。研究表明，大豆异黄酮是豆科植物中的一类黄酮类化合物，因为具有类雌激素活性被称为植物雌激素，具有抗氧化应激、消炎以及促进乳腺上皮细胞增殖等能力[3-5]。大豆异黄酮具有绿色、安全、有效等优点[6]。山楂的营养成分为黄酮类化合物、有机酸类、维生素C、钙、锰、锌、铜等矿质成分及碳水化合物[7]，主要为黄酮及黄酮醇类[8]，具有抗氧化和抗菌消炎等作用。将大豆异黄酮和山楂结合应用在奶牛上的研究较少。因此，本试验在奶牛热应激期间应用一种反刍动物专用自由基清除剂产品（主要成分为大豆异黄酮和山楂），并检测产奶量、乳指标及血清有关抗氧化指标，以期为奶牛场寻找出一个新的高效清除奶牛体内自由基而减缓奶牛热应激的产品，降低热应激损失。1材料与方法1.1试验材料试验动物为2群高产和1群低产中国荷斯坦奶牛。反刍动物专用自由基清除剂（益长素）由广东省农科院动科所研制，由广东新南都饲料科技有限公司提供。1.2试验设计与饲养管理试验于夏季在保定市清苑区九龙河农业开发有限公司进行。选择产奶量水平接近的2个高产奶牛群，随机选择其中1个90头的泌乳奶牛群为1组，饲喂奶牛场原有高产基础日粮；另1群泌乳奶牛97头为2组，在高产基础日粮中按1 kg/t精饲料的量添加自由基清除剂。选择另1个63头产奶末期的低产奶牛群作为试验3组，在低产基础日粮中按1.5 kg/t精饲料的量添加自由基清除剂。全混合日粮饲喂，试验期30 d。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.002.T001表1基础日粮组成及营养水平项目高产基础日粮低产基础日粮原料组成/%全株青贮玉米45.6848.47进口苜蓿11.568.76国产燕麦草4.354.70甜菜粕6.682.58棉籽4.674.12高产精料31.2029.81羊草01.55合计100.00100.00营养水平粗蛋白/%16.2214.56中性洗涤纤维/%31.2533.78酸性洗涤纤维/%20.4622.34产奶净能/(MJ/kg)6.315.89注：1.高产精料（牛场自配）组成：玉米47.67%、豆粕24.83%、棉粕6.95%、DDGS 7.94%、苏打1.69%、预混料4.97%、小麦麸5.96%。2.产奶净能为计算值，其余均为实测值。每天早中晚饲喂3次，挤奶2次，奶牛自由饮水。其他管理按牛场常规进行。试验期根据前期产奶记录，从每群牛中筛选出代表牛群平均水平的5头健康奶牛（均为2胎次，高产奶牛均为38~41月龄，单产记录平均33 kg；低产奶牛为44~47月龄，单产记录25 kg）作为收集乳样及血清的样本奶牛。1.3测定指标及方法1.3.1采食量每天记录每群牛的给料量及剩料量，计算每头牛的日均采食量。1.3.2产奶量每天记录每头牛的早晚产奶量，计算每头牛的日均产奶量。日均产奶量=早产奶量+晚产奶量（1）1.3.3乳品质试验前1 d、试验第15 d和第30 d分别采集每头样本牛早、晚2次挤奶的乳样，1∶1混合，放入奶样收集瓶中，送至石家庄DHI检测中心检测乳品质。乳品质包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、尿素氮和体细胞数等。1.3.4血清生化指标试验前1 d、试验第15 d和第30 d从各群固定的5头样本牛颈部分别抽取静脉血液10 mL，立即3 500 r/mim离心10 min，分离血清，将血清导入4 mL干净无菌的EP管，标记日期及牛号，立即带回实验室将置于-20 ℃冰箱中，贮存待检。血清总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量采用南京建成生物工程研究所试剂盒检测。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2007处理，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1自由基清除剂对奶牛采食量及产奶量的影响（见表2）由表2可知，在热应激期间，与第1~10 d和第11~20 d相比，1组奶牛21~30 d采食量极显著降低（P0.01）；2组采食量第11~20 d显著增加（P0.05），第21~30 d采食量极显著降低（P0.01）；3组随着时间推移，采食量极显著增加（P0.05）。与第1~10 d相比，第21~30 d时1组奶牛日均采食量降低4.42 kg、2组奶牛日均采食量降低0.91 kg、3组奶牛日均采食量增加5.17 kg。1组和2组产奶量基本无变化，3组呈先增加后降低的趋势，但影响不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.002.T002表2自由基清除剂对奶牛采食量及产奶量的影响项目组别第1~10 d第11~20 d第21~30 dP值SEM采食量1组43.23±1.71A42.04±2.41A38.81±1.30B0.0100.482组45.82±1.60ABa47.32±0.75Bb44.91±1.28Aa0.0100.293组34.74±0.67C36.81±0.97B41.13±1.64A0.0100.54产奶量1组32.38±2.3232.75±1.7832.70±1.890.9600.532组36.15±1.7236.30±2.1636.23±2.000.9940.513组17.57±1.0719.20±1.1017.90±0.790.1870.38注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。kg/（头·d）2.2自由基清除剂对奶牛乳品质的影响（见表3）由表3可知，随时间推移，1组和3组生鲜乳的干物质含量、乳脂率呈先降低后升高，2组呈逐渐升高，变化均不显著（P0.05）。与前1 d相比，第15 d时，1组牛乳中乳蛋白率显著降低（P0.05）；2组和3组牛乳中乳蛋白率均有逐渐升高趋势（P0.05）。随着时间推移，1组和2组牛乳中乳糖率先降低后增加，3组牛乳中乳糖率逐渐降低，变化均不显著（P0.05）；1组和2组牛乳中体细胞数逐渐上升，3组逐渐下降（P0.05）。与前1 d相比，1组和2组第30 d时牛乳尿素氮含量极显著升高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.002.T003表3自由基清除剂对奶牛乳品质的影响项目组别前1 d第15 d第30 dP值SEM干物质/%1组12.37±0.7811.95±0.1013.01±0.460.1170.222组12.24±1.0512.84±0.9313.57±1.730.4930.423组13.90±1.0612.18±0.1513.70±1.120.1060.37乳脂率/%1组3.99±0.513.40±0.083.59±0.140.1390.122组3.50±1.063.73±1.114.08±0.630.7620.293组3.71±1.413.36±0.323.62±0.210.8740.25乳蛋白率/%1组3.52±0.12a3.15±0.14b3.43±0.23ab0.0840.072组3.13±0.183.21±0.303.24±0.190.8160.073组3.39±0.173.47±0.243.50±0.030.7320.05乳糖率/%1组5.18±0.155.05±0.045.10±0.050.3060.032组4.98±0.134.69±0.555.00±0.050.4710.113组5.04±0.214.76±0.164.67±0.460.3690.10体细胞数/(×103/mL)1组28.00±14.1720.33±4.0440.00±18.020.2714.822组34.67±7.5126.33±5.6938.00±8.720.2192.753组38.67±17.5627.33±1.5328.00±8.000.4313.71尿素氮/(mg/L)1组136.00±0.10B139.00±0.26B156.30±0.21A0.0100.302组149.00±1.00B146.00±0.36B174.30±0.11A0.0030.503组143.70±1.18142.30±1.26151.70±2.260.7630.502.3自由基清除剂对血清抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，随着时间变化，各组奶牛血清总抗氧化能力均呈逐渐降低的趋势，但变化不显著（P0.05），且2组、3组降低趋势小于1组。与前1 d相比，第30 d的1组奶牛血清超氧化物歧化酶活性极显著降低（P0.01），2组显著降低（P0.05）；3组第15 d时极显著降低（P0.01）。1组奶牛第30 d过氧化氢酶活性极显著低于试验前1 d和第15 d（P0.01）；2组第15 d和第30 d极显著低于试验前1 d（P0.01）；3组第15 d极显著低于试验前1 d（P0.01），第30 d显著低于第15 d（P0.05）。1组奶牛第30 d血清谷胱甘肽过氧化物酶活性极显著低于试验前1 d和第15 d（P0.01）。与前1 d相比，1组奶牛第30 d血清丙二醛含量显著升高（P0.05）；2组、3组均有增加趋势，但变化不显著（P0.05）。1组一氧化氮含量逐渐上升但不显著（P0.05）；2组奶牛第30 d一氧化氮含显著低于试验前1 d（P0.05）；3组奶牛第30 d一氧化氮含极显著低于第15 d（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.002.T004表4自由基清除剂对奶牛血清抗氧化指标的影响项目组别前1 d第15 d第30 dP值SEM总抗氧化能力/(U/mL)1组5.38±0.674.83±1.144.24±1.380.2980.292组4.96±0.794.71±0.904.38±0.400.5830.213组4.72±0.744.66±1.014.51±1.160.9220.24超氧化物歧化酶/(U/mL)1组133.20±7.06Aa122.11±10.05ABa100.28±8.91Ba0.0104.862组116.20±8.34a121.90±9.29a103.29±6.52b0.0133.153组149.97±11.64A117.62±8.29B100.47±4.86B0.0107.68过氧化氢酶/(U/mL)1组74.96±9.26A76.03±5.28A59.35±4.34B0.0102.742组84.86±1.92A67.84±7.53B62.15±5.57B0.0103.243组84.75±3.84A69.90±6.82Ba60.31±4.32Bb0.0103.10谷胱甘肽过氧化物酶/(U/mL)1组1 456±27A1 356±72A1 001±117B0.01072.952组1 356±1861 290±671 148±480.10042.763组1 486±45A1 245±24B917±78C0.01067.50丙二醛/(μmol/L)1组5.04±0.96b5.69±0.39ab6.39±1.22a0.1100.272组4.76±0.595.21±1.155.80±0.350.1450.223组5.33±1.185.34±0.465.59±0.820.8640.21一氧化氮/(μmol/L)1组59.06±5.2568.40±6.3168.54±9.870.2142.342组81.48±8.85a71.65±1.65ab63.07±6.30b0.0333.233组65.85±2.08AB70.23±8.55A57.00±5.00B0.0232.343讨论3.1自由基清除剂对奶牛采食量及产奶量的影响本试验中，随着时间推移，1组奶牛采食量在热应激期间极显著降低，2组奶牛采食量先显著升高后显著降低，3组奶牛呈极显著增加趋势，说明该产品可以提高奶牛热应激期间的采食量，可能与该产品中山楂具有健胃消食作用有关。郝振荣等[9]研究表明，泌乳牛日粮中添加大豆黄酮有提高产奶量作用。但本试验两个高产牛群的产奶量变化均不显著，采食量变化显著，采食量与产奶量变化趋势不一致，可能与热应激期间体内代谢紊乱有关。大豆黄酮在奶牛不同的泌乳阶段表现出不同的效果，可以提高泌乳中期产奶量，对泌乳后期产奶量下降也有一定的阻遏作用，与本试验结果基本一致。3组奶牛产奶量增加，说明在低产（产奶末期）牛群添加该产品可以延缓产奶量降低作用，但产奶量变化与采食量增加幅度不匹配，可能因为妊娠后期奶牛采食大量营养主要用于供给胎儿。3.2自由基清除剂对奶牛乳品质的影响李琮等[10]研究表明，饲喂大豆黄酮的奶牛乳中乳脂率、乳糖率降低，可能因为产奶量提高；乳蛋白率、乳蛋白产量增加，尿素氮含量降低，可能因为大豆黄酮进入奶牛体内后会使血液中催乳素含量增加，然后与受体结合，导致核蛋白体 RNA升高，酪蛋白mRNA翻译转录速度增加，提高乳蛋白含量。大豆黄酮代谢产生的类雌激素物质可以调节机体氮代谢水平。本试验中，随时间推移，1组牛奶乳脂率、乳蛋白含量呈先降低后升高；2组逐渐升高；3组乳脂率先降低后增加，且增加幅度大于1组，乳蛋白含量逐渐增加。1组和2组体细胞数呈波动上升趋势，3组呈波动下降趋势，且2组上升趋势小于1组，说明该产品在提高乳品质主要指标上有一定的作用。在干物质含量方面2组表现较好。但在尿素氮方面各组基本呈上升趋势，第30 d，1组和2组极显著增加（P0.01）。乳尿素氮含量为120~190 mg/L、乳蛋白率≥3%时，饲料中粗蛋白质、能量较为平衡。本试验中，各组乳汁尿素氮含量为136~174.3 mg/L，说明各组日粮能氮平衡，3组改善尿素氮含量效果较好，但1组和2组到第30 d极显著增加与乳蛋白变化一致，与采食量变化相反，原因有待研究。3.3自由基清除剂对血清抗氧化指标的影响在热应激状态时，奶牛外周血中总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活力极显著降低，氧化产物丙二醛和一氧化氮含量升高[11-12]。奶牛机体的总抗氧化能力降低容易引起乳房炎、酮病、免疫力下降。大豆异黄酮类物质具有清除体内自由基、增强抗氧化酶活性、提高机体抗氧化的能力，可促进乳腺上皮细胞增殖，减少乳腺的氧化损伤[13-15]。大豆异黄酮的抗氧化能力与分子结构密切相关，起到清除自由基的作用[16]。随着大豆异黄酮分子中羟基数目和位置变化，抗氧化活性显著改变。山楂提取物具有较强的抗氧化活性。邱晓梅等[17]研究山楂对心肌损伤大鼠的影响时，发现山楂通过减少脂质过氧化反应起到对大鼠心肌损伤的保护作用。本试验结果表明，热应激期间各组奶牛血清抗氧化酶活性降低，2组降低趋势最小，1组丙二醛随着时间推移增加显著，2组和3组延缓丙二醛升高趋势。自由基清除剂对一氧化氮含量的影响显著，第30 d，2组和3组一氧化氮含量显著或极显著降低，1组一氧化氮含量逐渐升高。4结论在不同产奶水平奶牛日粮添加自由基清除剂可在一定程度上改善奶牛采食量、乳品质，增强抗氧化能力。但自由基清除剂对高产牛产奶量几乎无影响，对低产（产奶末期）牛群产奶量有一定影响。自由基清除剂对高、低产奶牛影响效果不一致。