藏羊（Tibetan sheep）作为中国三大原始绵羊品种之一[1]，生活在平均海拔为3.5 km以上的高寒、低氧的高原地区[2]。目前，青海省藏羊的数量占比最大[3]。藏羊对恶劣的生态环境具有较强的适应能力，具有体质结实、抗逆性及抗病能力较强等特点[4]。因此，对藏羊胃肠道独特的微生物群落的研究具有较高的价值。芽孢杆菌具有来源广、易筛选培养、能产生芽孢、胞外酶系丰富、抗菌谱广、生物安全性高和抗逆性强（耐高温、耐酸、耐碱）等优势[5]，在医学、林业、农业等方面被广泛研究与应用[6]。在医学上使用地衣芽孢杆菌联合加味交泰丸进行临床治疗，能够降低血清白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，对治疗腹泻型IBS肝郁脾虚有较好的效果[7]。在林业中，萎缩芽孢杆菌XW2对苹果树腐烂病菌菌丝生长、孢子的萌发及离体枝条的病斑扩展等方面有抑制作用[8]。解淀粉芽孢杆菌可以产生多种抑菌物质，在农业生产中应用广泛[9-10]。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是1种解淀粉芽孢杆菌后期异型体，是近几年新型的生防芽孢杆菌的研究热点[11-12]。贝莱斯芽孢杆菌是一类产芽孢的革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界[13]，能够产生多种次级代谢产物（如酶、抗菌物质、植物激素等），具有促进生长和广谱抑菌能力[14]。Feedap等[15]报道，贝莱斯芽孢杆菌符合添加剂授权条件。Li等[16]发现，贝莱斯芽孢杆菌作为饲料添加剂，能够改善动物机体肠道微生物菌群结构。孙长超等[17]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌可以调控机体脂代谢，增强免疫力。目前，关于从动物中分离贝莱斯芽孢杆菌作为益生菌的研究报道较少。本研究从藏羊瘤胃液中分离并鉴定了贝莱斯芽孢杆菌，明确抗逆性、生长特性和耐药性，旨在为藏羊来源益生芽孢杆菌的开发应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品及菌株藏羊瘤胃液采自青海省海北藏族自治州某养殖场。大肠杆菌（E. c1）、金黄色葡萄球菌（S. a1）、产气荚膜梭菌（C. p1）分离株由青海大学农牧学院青藏高原动物疾病研究室保存。1.1.2试剂纤维素刚果红培养基、胰蛋白胨大豆肉汤、LB琼脂、LB肉汤、细菌生化鉴定管，均购自青岛海博生物技术有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。1.2试验方法1.2.1纤维素降解菌的筛选、分离及形态观察将采集的瘤胃液置于胰蛋白胨大豆肉汤中，180 r/min、37 ℃恒温厌氧培养24 h。蘸取增菌液划线于纤维素刚果红培养基，37 ℃恒温培养48 h。挑取红色单菌落分离纯化，革兰氏染色，镜检，观察菌体形态特征。1.2.2分离菌株的鉴定1.2.2.1生理生化鉴定分离菌株的生理生化特征参照《常见细菌系统鉴定手册》[18]测定。具体按照细菌微量生化鉴定管使用说明书操作，记录结果并判定。1.2.2.2分子鉴定按照TaKaRa MiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌基因组。采用细菌通用引物27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492 R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[19]PCR扩增16S rDNA。扩增体系：Premix Taq 25 μL、上下游引物各1 μL、基因组DNA 0.5 μL、ddH2O 22.5 μL。扩增条件：95 ℃、30 s；58 ℃、30 s，72 ℃、90 s，35循环；72 ℃、5min。取5 μL PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，送交北京奥维森基因科技有限公司进行测序。根据16S rDNA测序序列结果进行BLAST比对，使用MEGA 7.0软件对序列多重比对，采用Neighbor-Joining法构建系统进化树[20]。1.2.3抑菌能力检测采用牛津杯法检测分离菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及产气荚膜梭菌的抑菌能力。将致病菌菌液浓度调整为1×108 CFU/mL，吸取100 μL涂布于营养琼脂上，无菌操作放置牛津杯，180 r/min、37 ℃恒温培养24 h的受试菌12 000 r/min离心10 min，吸取200 μL清液于牛津杯中，4 ℃冰箱预扩散12 h，37 ℃恒温培养12 h，测量抑菌圈直径。1.2.4分离菌株抗逆性试验1.2.4.1耐高温试验分离菌株按1%接种量接种于LB液体培养基中，分别在40、60、80 ℃（37 ℃为对照）水浴30 min，平板计数计算存活率[21]。菌株存活率=(处理组活菌数/对照组活菌数)×100%(1)1.2.4.2耐酸试验分离菌株按1%接种量接种到pH值为3.0、4.0、7.0、8.0（原液pH值6.7为对照）的LB液体培养基中，180 r/min、37 ℃恒温培养，分别在4 h和24 h进行平板计数，按照1.2.4.1的公式计算存活率。1.2.4.3胆盐抗逆性试验分离菌株按1%接种量接种到含质量分数为0.05%、0.10%、0.20%、0.30%（不含胆盐为对照）胆盐的LB液体培养基中[22]，180 r/min、37 ℃恒温培养，分别在2、4 h进行平板计数，按照1.2.4.1的公式计算存活率。1.2.5生长曲线的测定分离菌株按1%的接种量接种到LB液体培养基，180 r/min、37 ℃恒温培养30 h，每2 h利用紫外分光光度计测量吸光度（OD600 nm），记录数据并绘制生长曲线。1.2.6药物敏感性试验按照CLSI[23]推荐使用的纸片扩散法（K-B法）测定30种抗生素对分离菌株的抑菌圈直径，根据抑菌圈的直径大小判断分离菌株对抗生素的敏感性。2结果与分析2.1纤维素降解菌的筛选、分离及形态观察（见图1）由图1可知，经纤维素刚果红培养基分离培养，筛选到阳性疑似菌，该菌株菌落呈粉红色，表面有褶皱、边缘不整齐、四周呈云雾状扩散。革兰氏染色为阳性，镜检菌体呈杆状，芽孢呈短杆状，近端生。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.028.F001图1纤维素降解菌的形态学结果2.2分离菌株鉴定结果2.2.1分离菌株生理生化鉴定结果（见表1）由表1可知，分离菌株氧化酶试验、触酶试验、V-P试验、淀粉水解、西蒙氏枸橼酸盐、硝酸盐还原试验呈阳性；可发酵甘露醇、木糖、麦芽糖等多种糖类，产生酸但不产气；在7%氯化钠、pH值5.7生长管中可生长，不能利用丙酸盐，符合芽孢杆菌的主要细胞脂肪酸特征和生化代谢特征，命名为BV1-ql。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.028.T001表1分离菌株生理生化鉴定结果项目结果项目结果甘露醇+淀粉水解+山梨醇-吲哚试验-水杨苷-西蒙氏枸橼酸盐+棉籽糖-乳糖-木糖+纤维二糖-硫化氢-蔗糖+麦芽糖+甲基红-松三糖-V-P+阿拉伯糖-丙酸盐-葡萄糖+硝酸盐还原+果糖-氧化酶试验+7%氯化钠+触酶试验+pH值5.7生长管+葡萄糖发酵型注：+表示阳性，-表示阴性。2.2.2分离菌株分子鉴定结果（见图2、图3）由图2、图3可知，分离菌株16S rDNA PCR扩增出与预期相符的目的条带，序列长度为1 415 bp，登录号为89GMPJMF013。核苷酸序列与参考芽孢杆菌属菌株同源性高达96%以上，与贝莱斯芽孢杆菌同源性达100%且进化树共聚一支。结合生理生化特性确定分离菌株为贝莱斯芽孢杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.028.F002图2分离菌株PCR扩增电泳结果注：M为DL2000 DNA Marker；1为分离菌株；N为阴性对照。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.028.F003图3分离菌株的系统进化树2.3分离菌株抑菌能力检测结果分离菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌分离株的抑菌圈直径分别为6.00、11.28、34.8 nm，对产气荚膜梭菌的抑制能力最强。2.4分离菌株抗逆性试验结果2.4.1分离菌株耐高温试验结果（见图4）由图4可知，分离菌株在40 ℃水浴30 min，存活率高达173.06%；水浴温度逐渐升高，活菌率呈下降趋势，但仍能存活，说明分离菌株具备一定的耐高温能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.028.F004图4分离菌株耐高温试验结果2.4.2分离菌株耐酸试验结果（见图5）由图5可知，分离菌株在pH值3.0、4.0的LB液体培养基中培养4 h和24 h存活率在0.001 9%~0.006 7%之间；在pH值7.0、8.0的LB液体培养基中培养4 h的存活率在22%以上，而培养24 h存活率不到1%。说明pH值越小存活率越低，但仍可存活，对酸有一定的抵抗力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.028.F005图5分离菌株耐酸试验结果2.4.3分离菌株耐胆盐试验结果（见图6）由图6可知，分离菌株在0.05%~0.30%胆盐的LB培养液中培养2 h，存活率为0.05%~0.10%。表明胆盐对贝莱斯芽孢杆菌的存活有一定的抑制作用，但仍能在一定浓度胆盐环境中生存。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.028.F006图6分离菌株耐胆盐试验结果2.5分离菌株生长代谢曲线（见图7）由图7可知，分离株在接种培养的2 h内处于迟缓期，2 h后菌体代谢旺盛繁殖速度快，OD600 nm值迅速升高，2~18 h处于对数期，18~26 h生长速度变缓处于稳定期，26 h后进入衰亡期。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.028.F007图7分离菌株生长代谢曲线2.6药敏试验（见表2）由表2可知，贝莱斯芽孢杆菌分离株对青霉素、头孢唑林、四环素、新霉素、诺氟沙星、万古霉素、呋喃唑酮等大多数抗菌药物敏感；仅对多黏菌素耐药。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.028.T002表2贝莱斯芽孢杆菌分离株对不同药物的敏感性试验果药物药物含量/(μg/片)敏感程度药物药物含量/(μg/片)敏感程度青霉素10S新霉素30S氨苄西林10S庆大霉素10S羧苄西林100S丁胺卡那30S哌拉西林100S卡那霉素30S苯唑西林1S诺氟沙星10S头孢曲松30S环丙沙星5S头孢他啶30S氧氟沙星5S头孢呋辛30S复方新偌明25S头孢氨苄30S红霉素15S头孢拉定30S麦迪霉素30S头孢唑啉30S克林霉素2S头孢哌酮75S万古霉素30S四环素30S氯霉素30S多西环素30S多粘菌素30R米诺环素30S呋喃唑酮30S注：R表示耐药，S表示敏感，I表示中度敏感。3讨论芽孢杆菌胞外酶系丰富且产酶量高，可以分泌多种消化酶（如纤维素-复合酶、半纤维素酶、淀粉酶）[24]。这类酶有助于发酵降解饲料中的有机物，促进机体对营养物质的吸收[25]。本试验以纤维素粉为唯一碳源，用纤维素刚果红培养基筛选出纤维素分解菌贝莱斯芽孢杆菌，结合生化试验结果分析，贝莱斯芽孢杆菌具有产纤维素酶、淀粉酶、过氧化氢酶和氧化酶的能力，意味着贝莱斯芽孢杆菌具有帮助动物机体消化饲料的潜力。芽孢杆菌能产生多种抑菌活性物质（如脂肽类抗生素等）[26]。Ruiz-García等[27]发现，贝莱斯芽孢杆菌是具有广谱抑菌活性的拮抗细菌[28]，可以产生抗菌蛋白、脂肽类抗生素、非核糖体多肽合成酶和聚酮化合物合成的抗生素等抗菌物质来发挥抑菌作用[29]。柴玉龙等[30]从兔盲肠中筛选出贝莱斯芽孢杆菌的胞外产物能够抑制大肠埃希菌活性。王金燕等[31]从刺参养殖池塘中筛选出的贝莱斯芽孢杆菌对假交替单胞菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌均有良好的抑制作用。本试验与上述研究结果相似，研究分离的藏羊源贝莱斯芽孢杆菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌表现出较强的抑菌能力，且贝莱斯芽孢杆菌分离株经过80 ℃水浴30 min、pH值3.0和0.3%胆盐胁迫培养均能部分存活，具有成为益生菌的基础条件和潜力。本试验结果与张小波等[32]和唐萍等[33]报道的结果一致。本次藏羊源贝莱斯芽孢杆菌对临床常用的β-内酰胺类、大环内酯类和氨基糖苷类等29种常用抗生素敏感，仅对多黏菌素B耐药。在实际应用中低耐药益生菌能够避免动物机体内微生物之间抗生素抗性转移，减少部分微生物耐药性的产生[34]。4结论试验从健康藏羊瘤胃液中筛选得到一株纤维素降解菌，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，该分离对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及产气荚膜梭菌有较强的抑制能力，且抗逆性较强、生长速度快、对氨苄西林等29种常用抗生素表现敏感，具有良好的生物学特性，可作为饲用芽孢杆菌进行深入研究。