柑橘渣是柑橘加工产业的副产物,年产量达600万t,价格便宜,可以作为非常规饲料资源[1]。柑橘渣主要由60%柑橘皮、30%橘络、0~10%种子组成,富含大量可消化粗纤维。在日粮中添加一定量的柑橘渣对动物肠道菌群生长发育具有积极作用[2]。近年来,对柑橘渣的研究主要集中在柑橘渣中活性物质的提取和生物转化[3]。在日粮中添加柑橘渣对动物肠道菌群的影响方面的研究较少。本研究采用Illumina-Miseq高通量测序技术分析肉鸡盲肠微生物多样性和物种组成,试验研究添加不同处理的柑橘渣对肉鸡盲肠微生物的影响,旨在探究肉鸡盲肠中菌群变化,为柑橘渣作为饲料原料的可行性提供参考。1材料与方法1.1试验材料柑橘渣常规营养成分分析见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.011.T001表1柑橘渣常规营养成分分析样品干物质无氮浸出物粗蛋白粗脂肪粗纤维粗灰分钙磷吸附水柑橘渣93.5972.996.111.959.592.950.610.136.41青贮柑橘渣82.9452.048.723.9813.234.970.750.1717.06%1.2试验设计选用体重相近的18只21日龄爱拔益加(AA)肉鸡,随机分为3组,每组3个重复。分别在3组AA肉鸡的日粮中不添加柑橘渣(Ⅰ组)、添加2.5%干燥粉碎的柑橘渣(Ⅱ组)和2.5%青贮柑橘渣(Ⅲ组)。试验期21 d(21~42日龄)。试验日粮根据NRC(1994)肉鸡饲养标准,并结合我国肉仔鸡饲养技术[4]配制,按照预先设计量进行预混,再用搅拌机充分混合;平模制粒机制成颗粒料,烘干,称重,装袋,封口和标记,并储存于通风干燥处备用。基础日粮组成及营养水平见表2。试验肉鸡自由采食、自由饮水。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.011.T002表2基础日粮组成及营养水平(风干基础)项目Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组原料组成/%玉米50.0050.0060.00豆粕16.4315.0016.18膨化大豆14.2019.774.99小麦10.004.774.99鱼粉2.002.000玉米蛋白粉2.050.445.99磷酸氢钙0.580.860.50石粉1.331.251.50柑橘渣02.502.50油脂2.002.002.00食盐0.350.350.35蛋氨酸0.060.060预混料1.001.001.00合计100.00100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)13.3913.3912.84粗蛋白/%20.0020.0018.19钙/%0.900.900.78有效磷/%0.350.350.31蛋氨酸/%0.720.720.31赖氨酸/%1.071.071.00注:1.预混料为每千克日粮提供:Mn 120 mg、Fe 100 mg、Cu 8 mg、Zn 100 mg、Se 0.3 mg、I 0.7 mg、VA 12 000 IU、VD3 3 500 IU、VE 40 mg、VK3 3.0 mg、VB1 3 mg、VB2 10 mg、VB6 4.5 mg、泛酸12 mg、烟酸60 mg、叶酸1.0 mg、生物素0.15 mg、胆碱600 g、VB12 0.01 mg。2.营养水平均为计算值。1.3样品采集42日龄时,对18只肉鸡进行屠宰取样,对盲肠上1/3肠段采用双端结扎的办法收集盲肠食糜,迅速装入5 mL冻存管中置于液氮中暂时保存,-80 ℃超低温冰箱保存。1.4检测指标及方法将18份样品置于液氮罐中送至广州基迪奥生物科技有限公司使用Illumina-Miseq平台测序。从样品中提取基因组DNA,使用带有barcode的特异引物341F: CCTACGGGNGGCWGCAG;806R: GGACTACHVGGGTATCTAAT,扩增16S rDNA的V3+V4区。PCR扩增产物切胶回收,使用QuantiFluor TM荧光计进行定量。等量混合纯化后的扩增产物,连接测序接头构建测序文库,使用Hiseq2500 PE250上机测序。1.5数据统计与分析使用FASTP软件进行Reads质控,对原始下机数据进行过滤、Tags拼接、Tags过滤和Tags去嵌合体后得到的Effective Tags序列使用Uparse软件聚类,以97%的一致性将序列聚类成操作分类单元(OTUs)。使用QIIME软件进行α多样性指数分析和稀释曲线分析。使用RDP classifier软件进行物种注释。使用R语言Vegan包基于样本间距离指数进行NMDS分析。采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA),分别分析在门和属水平的显著性(P0.05)。2结果与分析2.1OTU质控分析(见表3、图1)由表3可知,此次测序18个样本的覆盖率均在98.9%以上,有效序列占原始读取序列的80%以上,对比得到的OTU数每个样本均在1 500以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.011.T003表3测序数据统计样本原始读取序列有效序列有效比率/%覆盖率/%分类操作单元Ⅰ-1112 37699 17388.250.991 71 705Ⅰ-2107 23596 94290.400.992 11 633Ⅰ-3114 79398 95286.200.990 42 048Ⅰ-4101 40987 70586.490.989 81 845Ⅰ-5101 08291 00590.030.991 61 571Ⅰ-6103 23992 51489.610.991 41 549续表3 测序数据统计10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.011.T004样本原始读取序列有效序列有效比率/%覆盖率/%分类操作单元Ⅱ-1113 05995 16984.180.990 21 937Ⅱ-2107 37086 88880.920.989 91 639Ⅱ-3108 61192 10684.800.991 11 744Ⅱ-4110 11398 07089.060.990 81 758Ⅱ-5104 14693 92790.190.991 91 568Ⅱ-6103 72091 77588.480.989 01 782Ⅲ-1102 60291 96889.640.991 41 674Ⅲ-2111 44095 36985.580.993 31 580Ⅲ-3108 19795 49588.260.990 31 762Ⅲ-4106 54194 34988.560.989 81 770Ⅲ-5103 06290 87388.170.989 51 705Ⅲ-6113 98298 26786.210.991 61 771由图1可知,稀释曲线随着测序量的不断增大而逐渐趋于平缓,当测序深度达到40 000 tags之后,曲线趋向平台期,说明测序深度足够,曲线具有代表性和真实性,能够反映样本中微生物组成及多样性信息。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.011.F001图1测序样本稀释曲线2.2柑橘渣对肉鸡盲肠α、β多样性的影响2.2.1柑橘渣对肉鸡盲肠α多样性的影响(见表4)α多样性指利用物种丰度和物种均匀度两个重要参数来计算特定生态环境或生态系统内的多样性情况。Observed species(Sobs)、菌群丰富度(Chao1)、菌群均匀度(ACE)指数主要反映样本的物种丰度,香浓指数和辛普森指数能够综合反映物种丰度和均匀度。Observed species表示检测到的OTU个数。由表4可知,Ⅱ组检测到的平均OTU个数有1 738个,高于Ⅰ组和Ⅲ组。Ⅲ组香浓指数和辛普森指数略低于Ⅰ组和Ⅱ组,3组差异不显著(P0.05)。试验物种丰度和均匀度无显著差异(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.011.T005表4柑橘渣对肉鸡盲肠α多样性指数的影响组别Observed species指数香浓指数辛普森指数Chao1指数ACE指数Ⅰ组1 725.17±190.947.45±0.210.98±0.012 402.05±259.912 481.67±259.45Ⅱ组1 738.00±127.027.45±0.240.98±0.012 447.56±196.022 502.81±175.68Ⅲ组1 710.33±75.167.12±0.690.96±0.042 475.76±162.132 523.41±152.842.2.2柑橘渣对肉鸡盲肠β多样性的影响(见图2)β多样性是指生态系统间物种多样性的差异,与物种有无、物种丰度有关。非度量多维尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling,NMDS)是一种基于距离排名的降维分析方法,可以使用二维平面直观展现样本间的距离,以散点图的形式体现分组特征,克服线性模型(如PCA)的缺点。使用Stress值评估模型的准确性,其值越小的模型越可靠。由图2可知,Stress值小于0.1,说明该模型可靠性较好;Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组样本散点在图上距离相近,表示3个组菌群组成相似。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.011.F002图2NMDS图2.3柑橘渣对肉鸡盲肠优势物种的影响应用Illumina Miseq平台高通量测序,共得到26个门,51个纲,119个目,175个科,343个属,155个种。2.3.1门水平下柑橘渣对肉鸡盲肠对前10优势物种的影响(见表5、图3)由表5可知,肉鸡盲肠前十位的优势菌门是Firmicutes(厚壁菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Verrucomicrobia(疣微菌门)、Cyanobacteria(蓝细菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Patescibacteria、Planctomycetes(浮霉菌门)、Tenericutes(软壁菌门)、Chlamydiae(衣原体门)。Ⅱ组Actinobacteria(放线菌门)丰度显著高于Ⅰ组;Ⅲ组Tenericutes(软壁菌门)丰度显著高于Ⅰ组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.011.T006表5门水平下柑橘渣对肉鸡盲肠前10优势物种的影响门Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组P值Firmicutes56.840 651.349 349.426 80.05Bacteroidetes33.247 935.900 131.657 60.05Proteobacteria3.873 74.344 24.703 20.05Verrucomicrobia0.321 92.702 09.388 70.05Cyanobacteria4.444 02.637 32.208 80.05Actinobacteria0.651 4a2.373 1b1.827 1ab0.05Patescibacteria0.210 00.129 80.234 60.05Planctomycetes0.157 90.221 00.189 60.05Tenericutes0.042 4a0.070 1ab0.143 3b0.05Chlamydiae0.012 20.057 60.019 60.05Other0.065 90.050 10.042 60.05Unclassified0.132 10.165 50.157 90.05注:同行数据肩标字母不同表示差异显著(P0.05),字母相同或无字母表示差异不显著(P0.05);下表同。%由图3可知,Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度依次降低,疣微菌门(Verrucomicrobia)相对丰度依次升高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.011.F003图3门水平前10物种分布堆叠图2.3.2属水平下柑橘渣对肉鸡前10优势物种的影响(见表6、图4)在属水平上共检测到343个菌属。由表6可知,肉鸡盲肠前十的优势菌属为Alistipes(另枝菌属)、Barnesiella、Faecalibacterium(瘤胃球菌属)、Akkermansia(阿克曼菌属)、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Ruminococcus_torques_group(瘤胃杆菌属)、Ruminococcaceae_UCG-014、Lactobacillus(乳杆菌属)、Christensenellaceae_R-7_group、Flavonifractor。Ⅲ组Faecalibacterium(瘤胃球菌属)丰度显著高于Ⅰ组(P0.05);Ⅱ组Lactobacillus(乳杆菌属)丰度显著高于Ⅲ组(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.011.T007表6属水平下柑橘渣对肉鸡对前10优势物种的影响属Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组P值Alistipes22.855 624.573 618.681 20.05Barnesiella4.252 23.673 24.085 70.05Faecalibacterium2.036 8a3.169 3ab4.904 6b0.05Akkermansia0.317 02.698 49.385 70.05Eubacterium_coprostanoligenes_group3.775 12.641 42.791 70.05Ruminococcus_torques_group3.582 82.144 73.828 90.05Ruminococcaceae_UCG-0143.114 62.263 42.182 30.05Lactobacillus2.382 8ab4.106 4b1.089 2a0.05Christensenellaceae_R-7_group2.328 61.630 11.753 00.05Flavonifractor1.279 91.546 11.846 30.05Other20.786 520.548 219.288 90.05Unclassified33.289 131.005 230.162 70.05%由图4可知,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组中,Akkermansia(阿克曼菌)属所占比例明显升高,Ⅱ组Lactobacillus(乳杆菌)属丰度显著高于Ⅰ组和Ⅲ组(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.13.011.F004图4属水平前10物种分布堆叠图3讨论本试验通过Illumina-Miseq平台高通量测序技术,获得的18个样本的覆盖率均在98.9%以上,对比得到的OTU数每个样本都在1 500以上,测序的深度和广度足够[5],相较于传统方法更全面准确。并通过多样性分析和物种组成分析展示肉鸡盲肠菌群丰富度和优势菌群组成,对进一步探究潜在益生菌具有重要意义。肉鸡肠道中微生物菌群丰富多样,受到遗传、环境和营养等方面的影响,不仅维持机体动态平衡,菌群之间也存在一定比例关系。本试验肉鸡肠道主要优势菌门是厚壁菌门:Ⅰ组占比56.84%、Ⅱ组占比51.35%、Ⅲ组占比49.43%;拟杆菌门:Ⅰ组占比33.25%、Ⅱ组占比35.90%、Ⅲ组占比31.66%。有研究表明,门水平上丰度较高的是厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门[6],与本试验分析结果一致。α多样性分析结果显示Ⅲ组的香浓指数和辛普森指数略低于Ⅰ组和Ⅱ组;Ⅲ组Chao1指数和ACE指数高于Ⅰ组和Ⅱ组。Ⅲ组的物种丰度较高而均匀度较差的原因可能是青贮柑橘渣发酵产生的微生物降低了肠道菌群的均匀度,影响了盲肠微生物菌群的平衡。肠道微生物是影响宿主营养吸收、能量代谢、免疫抑制和激活以及生长繁殖的重要因素[7-8]。肉鸡的胃肠道微生物群对宿主健康起到重要作用[9]。肠道菌群平衡是维持肉鸡正常生长的必要条件,肠道菌群紊乱尤其是致病菌的增加会导致肉鸡患病。肠道有益菌能通过占位作用或分泌有抑菌作用的代谢物,影响病原菌在肠道的定殖,减少肉鸡患病率[10]。肠道微生物菌群的主要功能是通过宿主免疫应答和直接竞争宿主有限的养分形成屏障[11]。肠道有益菌属丰富度提高能够有效减少病原微生物的定殖。Sun等[12]研究表明,与对照组相比,感染大肠埃希菌(变形菌门)的试验组肠道菌群多样性显著下降,厚壁菌门和疣微菌门丰度显著降低,放线菌门和变形菌门丰度显著高于对照组;在属水平上,试验组的肠球菌属、普雷沃菌属、阿克曼菌属等有益菌属显著低于对照组。本试验中,日粮添加2.5%干燥粉碎的柑橘渣显著提高肉鸡肠道中乳杆菌属的丰度;添加2.5%青贮柑橘渣提高阿克曼菌属丰度。结果表明,添加适量柑橘渣能够一定程度上提高有益菌属如乳杆菌属和阿克曼菌属丰度,对肉鸡肠道健康起积极作用。日粮中添加适量的纤维物质能够促进盲肠微生物菌群的生长发育,为机体提供一定量的碳水化合物和蛋白质营养。张奇等[13]研究发现,日粮中添加适量纤维物质,能够刺激乳酸菌生长。但粗纤维水平过高会稀释日粮能量水平,降低营养物质的消化率和家禽采食量。彭涵等[14]研究表明,日粮中粗纤维水平不宜超过7%,过高会影响肉鸡的生长性能。郭爱伟等[15]报道,成年肉鸡日粮中粗纤维含量不应超过7%,肉仔鸡不应超过3%。本试验对干燥粉碎的柑橘渣和青贮柑橘渣进行常规营养成分分析,结果表明,干燥粉碎的柑橘渣的粗纤维含量是9.59%,青贮柑橘渣的粗纤维含量是13.23%。因为日粮中只添加2.5%的柑橘渣,所以肉鸡的生长性能不会降低。薛垂喜[16]研究表明,日粮中添加适量青贮玉米秸秆可以提高泰州白鹅盲肠中双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌数量。说明日粮中添加青贮饲料对提高肠道有益菌群占比有一定作用。4结论添加2.5%干燥粉碎的柑橘渣能够显著提高肉鸡肠道乳杆菌属的丰度,添加2.5%青贮柑橘渣能够明显提高阿克曼菌属的丰度。
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