犊牛幼年期非常重要，在生长过程中，断奶是犊牛面临的最重要问题之一。抗生素会使细菌病毒产生耐药性，对环境和人类健康造成危害[1]。近年来，使用益生菌微生态制剂取代抗生素已成为新趋势。微生态制剂可以增加经济效益，避免使用抗生素带来的危害。益生菌和寡糖组合形成的合生元已在动物上展开研究，益生菌和甘露寡糖对早期断奶仔猪的免疫机能有改善作用，且腹泻率显著低于对照组[2]。Zhang等[3]在肉仔鸡日粮中添加复合益生菌，发现肉仔鸡血清中IgA和IgM含量显著提高。本试验通过研究复合微生态制剂联合甘露寡糖饲喂断奶期犊牛，研究对断奶犊牛粪便评分、血清免疫及抗氧化指标的影响，为犊牛健康发展提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验用复合微生态制剂为石河子大学生物技术实验室收藏的3个菌种，包含嗜酸性乳杆菌、枯草芽孢杆菌和布拉氏酵母，3种菌株益生菌复合物的比例为3∶3∶1（1 g MSP含嗜酸乳杆菌3×109 CFU、枯草芽孢杆菌3×109 CFU和布拉氏酵母1×109 CFU）；甘露寡糖，纯度≥98%，选取3 g作为此试验的添加量[4-6]。1.2试验设计试验选择32头50日龄荷斯坦母犊牛，随机分为4组，每组8个重复。试验犊牛分别单独饲养。对照组犊牛饲喂开食料，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别在开食料中添加3 g甘露寡糖、3 g甘露寡糖+3 g复合微生态制剂和3 g复合微生态制剂。预试期7 d，正式试验期20 d。开食料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.003.T001表1开食料组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米55.20消化能/(MJ/kg)16.41豆粕18.50干物质/%87.33玉米蛋白粉10.00粗蛋白质/%19.92玉米酒精糟13.00粗脂肪/%4.64石粉1.80粗灰分/%5.38氯化钠0.50中性洗涤纤维/%16.53预混料1.00酸性洗涤纤维/%6.02钙/%1.15磷/%0.58注：1.预混料为每千克开食料提供：VA 15 000 IU、VD 5 000 IU、VE 50 mg、Fe 90 mg、Cu 12.5 mg、Mn 30 mg、Zn 90 mg、Se 0.3 mg、I 1.0 mg、Co 0.5 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值1.3饲养管理犊牛断奶前于每日6：00、12：00、19：30饲喂巴氏杀菌乳，为减少犊牛断奶应激，采取循序渐进式断奶，饲喂量随日龄的增加首先减至每日两顿（4 L），后减至1顿，直至完全断奶，断奶后定量补饲苜蓿。犊牛全期自由进食，并有充足水源。同时，按照牛场管理定期用碘可安对犊牛岛消毒。苜蓿营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.003.T002表2苜蓿的营养水平（风干基础）营养水平苜蓿干物质91.33粗蛋白质16.72粗脂肪1.56粗灰分8.17钙1.33磷0.25%1.4测定指标及方法1.4.1粪便评分试验期间每日观察犊牛排粪情况，粪便评分参照Lee等[7]的方法。粪便评分标准见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.003.T003表 3粪便评分标准评分外观形态1外观较硬形状正常2软并松散成形3松散呈水样不成形4水样、黏液不成形5水样、黏液、血丝不成形1.4.2血液样本的采集与指标测定分别于试验第1、10和20 d晨饲前，通过颈静脉每组随机采集6头犊牛血液样品于抗凝采血管中，放置片刻后，3 000 r/min离心20 min，血清装入无菌离心管中，-20 ℃保存待测。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、丙二醛（MDA）含量与超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性，具体操作按照说明书进行。采用上海语纯生物科技有限公司生产的试剂盒测定白介素1（IL-1）、白介素2（IL-2）、白介素4（IL-4）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量。1.5数据统计与分析采用SPSS软件分析数据，结果以“平均值±标准差”表示。组间差异性比较采用单因素方差分析后，采用最小显著性差异法（LSD）比对，P0.05表示显著差异。2结果与分析2.1复合微生态制剂和甘露寡糖对断奶犊牛粪便的影响（见表4）。由表4可知，试验第1~10 d，与对照组相比，各试验组犊牛粪便评分均降低；第11~20 d，Ⅱ组犊牛的粪便评分低于其他各组（P0.05）；全期1~20 d，Ⅱ组犊牛粪便评分显著低于对照组（P0.05），与其他各组无显著差异(P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.003.T004表4复合微生态制剂和甘露寡糖对断奶犊牛粪便的影响组别1~10 d11~20 d1~20 d对照组1.27±0.111.14±0.051.20±0.06aⅠ组1.26±0.091.12±0.051.19±0.07abⅡ组1.20±0.121.06±0.071.14±0.08bⅢ组1.20±0.071.08±0.091.15±0.02ab注：同列数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2复合微生态制剂和甘露寡糖对断奶犊牛血清免疫指标的影响（见表5）由表5可知，试验第10 d，各组犊牛血清IgA、IgM、IgG含量无显著差异（P0.05）；试验第20 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组犊牛血清IgA含量较对照组分别提高3.91%、6.36%和2.31%（P0.05），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组犊牛血清IgM含量较对照组分别提高0.92%、4.98%、3.70%（P0.05），Ⅱ组犊牛血清IgG含量显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.003.T005表5复合微生态制剂和甘露寡糖对断奶犊牛血清免疫指标的影响项目对照组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组IgA1 d3 630.85±152.253 700.45±160.873 687.28±155.633 543.36±75.9810 d2 563.39±145.161 789.72±176.822 772.84±224.022 670.81±194.5420 d2 688.88±147.352 793.49±166.252 859.32±245.452 750.04±137.90IgM1 d1 575.27±56.021 592.11±126.991 578.86±66.581 557.18±47.9610 d1 624.02±124.021 641.94±122.601 620.97±164.561 634.82±87.1120 d1 407.19±63.051 420.23±85.201 477.04±147.921 459.07±108.09IgG1 d5 700.00±360.565 830.00±369.746 123.33±132.045 770.00±251.2010 d4 300.00±200.754 036.67±260.484 293.33±237.144 733.33±246.6420 d2 350.00±271.49b2 566.67±244.20ab3 590.00±346.99a2 826.67±360.19ab注：同行数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mg/L2.3复合微生态制剂和甘露寡糖对断奶犊牛血清细胞因子的影响（见表6）由表6可知，试验第10 d，各组犊牛血清IL-1、IL-2、IL-4和TNF-α含量无显著差异（P0.05）；试验第20 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组犊牛血清IL-1含量较对照组分别降低3.80%、10.00%和8.38%（P0.05），Ⅱ组犊牛血清IL-2含量较对照组显著提高（P0.05），Ⅱ组犊牛血清TNF-α含量显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.003.T006表6复合微生态制剂和甘露寡糖对断奶犊牛血清细胞因子的影响项目对照组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组IL-11 d110.46±8.45106.91±9.82109.24±6.39105.73±9.7710 d113.54±8.22106.24±8.61104.24±4.63104.72±5.9220 d109.24±5.16105.09±5.9898.31±5.70100.09±8.63IL-21 d273.90±18.87265.49±19.62268.31±22.52270.62±23.0910 d277.38±19.25273.18±19.26281.21±21.22278.92±16.8720 d267.21±19.43b278.59±18.99ab299.18±16.95a279.82±23.34abIL-41 d81.37±6.2481.86±6.4786.73±5.0683.19±8.1510 d86.18±7.7093.00±5.04102.31±6.6297.15±7.4220 d82.04±4.2686.85±4.4090.29±5.2087.53±6.56TNF-α1 d238.48±19.87231.08±22.41235.78±12.15234.78±14.3310 d266.17±16.07259.79±14.54252.40±15.50258.26±20.3920 d266.57±15.86a241.72±17.09ab232.91±19.04b238.40±17.59abng/L2.4复合微生态制剂和甘露寡糖对断奶犊牛抗氧化指标的影响（见表7）由表7可知，试验第10 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组犊牛血清SOD活性较对照组分别提高1.1%、4.3%和2.0%（P0.05）；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组犊牛血清CAT活性较对照组分别提高0.75%、2.63%和1.88%（P0.05），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组犊牛血清丙二醛含量较对照组分别降低2.39%、5.37%和2.69%（P0.05）。试验第20 d，Ⅱ和Ⅲ组犊牛血清中MDA含量显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.003.T007表7复合微生态制剂和甘露寡糖对断奶犊牛血清抗氧化指标的影响项目对照组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组SOD/(U/mL)1 d126.93±9.86128.44±8.67125.03±9.86123.61±5.5710 d130.01±8.98131.44±9.25135.62±5.53132.61±9.5420 d127.36±10.34129.94±7.85131.03±7.85130.11±8.66CAT/(U/mL)1 d2.60±0.152.58±0.222.59±0.252.61±0.2410 d2.66±0.212.68±0.172.73±0.242.71±0.1520 d2.54±0.172.54±0.162.55±0.152.54±0.22MDA/(μmol/L)1 d3.30±0.553.34±0.433.46±0.563.24±0.4110 d3.35±0.563.27±0.643.17±0.363.26±0.4620 d3.69±0.35a3.26±0.31ab2.45±0.47c2.67±0.24bc3讨论3.1复合微生态制剂和甘露寡糖对断奶犊牛粪便的影响断奶时期的犊牛自身免疫力较弱，断奶后液体饲料完全转变成固体饲料的变化与环境的刺激，极易造成犊牛肠道微生物区系的失衡，从而造成腹泻，直接影响犊牛的生长性能和健康参数。戴兆来等[8]研究表明，乳酸菌和化学益生素饲喂断奶期的仔猪可以显著降低仔猪的腹泻率，与黄俊文等[2]研究结果一致。仔猪日粮中添加纳豆芽孢杆菌和甘露寡糖，可以减少腹泻发生率。Abe等[9]给犊牛口服双歧杆菌、乳酸菌，并对粪便进行监测，结果显示，饲喂益生菌组犊牛腹泻发生频率较对照组降低，表明益生菌可以有效改善新生幼牛的粪便状况。本试验中，饲喂复合微生态制剂和甘露寡糖的犊牛在整个试验周期的粪便评分显著低于对照组，与上述研究结果一致。原因可能是添加益生菌可以提高饲料在胃肠道中的消化率，减少犊牛营养性腹泻的发生率。在犊牛日粮中添加甘露寡糖可以极显著降低犊牛腹泻率，提高犊牛生长性能，增加经济回报率[10]。本试验中，复合微生态制剂增加胃肠道有益菌的定植，甘露寡糖作为营养物质，促进有益菌生长，同时抑制大肠杆菌等致病菌的繁殖，维持体内环境稳定，降低犊牛的粪便评分。3.2复合微生态制剂和甘露寡糖对断奶犊牛免疫指标的影响免疫球蛋白是抵御病原菌的第一道防线，可以反映机体免疫能力[11]。研究表明，甘露寡糖和益生菌均对动物免疫功能有一定的影响，甘露寡糖是致病菌（如大肠杆菌和沙门氏菌等）甘露聚糖特异性Ⅰ型菌毛的高亲和力配体[12]，可以使机体发生免疫反应[13]。益生菌通过在肠道黏附刺激免疫细胞产生细胞因子提高免疫力。研究表明，在仔鸡日粮中添加复合菌剂，饲喂6 w，仔鸡血清中IgG、IgA和IgM含量均显著提高，表明复合菌剂能显著提高仔鸡免疫力[14]。刘华伟等[15]给奶牛饲喂含乳酸菌制剂的混合料，发现试验组犊牛血清中IgG和免疫细胞CD4含量增加。糖蛋白具有增加抗原效价，原理是通过结合入侵有害细菌，从而延缓抗原吸收，提高抗原活性，而甘露寡糖可以促进机体产生此类物质[16]。金亚东等[17]发现，在开食料或牛奶中添加甘露寡糖均能够对犊牛免疫有促进作用。段绪东[18]发现，摄入甘露寡糖的仔猪非特异性免疫应答能力明显增强。研究表明，若动物近期产生感染，血清中IgM含量有提高趋势[19]。本试验中，IgA和IgM含量没有显著变化，但添加复合微生态制剂和甘露寡糖的犊牛在试验20 d时IgG含量显著高于对照组，联合作用的免疫效果要优于两者单独添加，推测益生菌因获得来自寡糖的碳源从而定植于机体肠道中，导致致病菌难以附着，且对机体免疫因子耐受性降低，从而提高机体免疫力[20]。IL-1是由巨噬细胞分泌的一种淋巴细胞刺激因子，可以诱导强大的炎症反应[21]，从而引起细胞损伤。IL-2是由T细胞产生并是其在体外生长所必需的因子，能够刺激T细胞生长，又称为T细胞生长因子[22]。IL-4可以通过阻止促炎因子合成，减轻炎症反应的伤害[23]。TNF-α由巨噬细胞产生，具有杀伤及抑制肿瘤细胞、抗感染的作用。研究表明，湖羊免疫球蛋白及IL-2含量因添加的枯草芽孢杆菌而提高[24]。李玉欣[25]通过添加甘露寡糖，发现其能够提高免疫因子含量，减轻断奶仔猪免疫反应。Christian等[26]研究表明，酿酒酵母的添加能够使肉牛中性粒细胞和白细胞数量增加。李宁等[23]研究表明，活性干酵母组犊牛血清IL-2、TNF-α含量显著高于对照组，机体可能通过激活中性粒细胞、白细胞等非特异性免疫细胞来实现。本试验结果与上述研究一致，添加复合微生态制剂和甘露寡糖能够显著提高犊牛IL-2及TNF-α含量，减少炎症，对提高机体免疫力有促进作用。3.3复合微生态制剂和甘露寡糖对断奶犊牛抗氧化指标的影响益生菌通过清除自由基过氧化脂质、产生过氧化氢从而提高抗氧化性能，且提供的酸性环境有利于SOD等对矿物质的吸收[27]。机体内自由基的生成能力和抗氧化清除自由基能力保持平衡，机体由于疾病等原因，容易造成体内自由基增加，此时机体会通过抗氧化作用继续保持平衡[19]。SOD是动物体内重要的抗氧化酶[28]，可以间接反映机体清除自由基的能力。CAT可以促进过氧化氢的分解，从而起到抗氧化作用[29]。血液中MDA含量代表氧化程度[30]。程连平等[24]在羔羊日粮中添加枯草芽孢杆菌，发现羔羊血液中MDA含量有下降趋势。Zhang等[31]发现，在1.6%甘露寡糖剂量下，绵羊血清中总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性显著提高，MDA含量显著降低。梁金逢等[32]研究表明，在育成牛日粮中添加MOS和益生菌，牛血清中的SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著增加，说明甘露寡糖配合益生菌可以提高育成牛机体的抗氧化能力。本试验结果与上述研究一致，饲喂复合微生态制剂和甘露寡糖的犊牛血清中MDA含量显著低于对照组，且效果优于两者单独添加，表示甘露寡糖和复合益生菌在提高抗氧化能力方面具有协同效果。各组犊牛血清中CAT及T-SOD活性之间无显著差异，但与对照组相比有一定程度的提高。4结论本试验中，犊牛断奶前，饲料中补充复合微生态制剂和甘露寡糖可以提高SOD、CAT活性及IgA、IgM含量，显著增加IgG含量，显著降低MDA含量和粪便评分。