维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是一种革兰氏阴性菌，隶属气单胞菌科（Aeromonadaceae），气单胞菌属（Aeromonas）[1]，广泛存在于土壤及淡水环境中。在水产养殖中，6~9月为该菌的增殖活跃期。A. veronii部分菌株会使鲤鱼、鲟鱼、鲈鱼等出现出血性败血症，主要表现为体表及脏器不同程度的出血和充血[2]；可以引起黄颡鱼的“溃疡综合征”，主要表现为体表溃疡和溃烂[3]；可以导致青虾、甲鱼的“软壳综合征”，主要表现为掉肢、软壳以及肌肉水肿[4-5]；可以引起克氏原螯虾的虾肝胰腺、肠道与心脏组织病理损伤[6-7]。因维氏气单胞菌感染引起的水产养殖场的疾病逐年增多，给水产养殖业造成巨大的经济损失[2]。柠檬香茅（Cymbopogon flexuosus）精油的挥发性成分主要为橙花醛（占33.14%）和香叶醛（42.29%）；爪哇香茅（Cymbopogon winterianus）精油的挥发性成分为香茅醛（占比38.57%）、香叶醇（占比16.13%）及少量香茅醇和乙酸乙酯[8]。香茅精油常温下为亮黄色油状液体，在空气中易挥发、微溶于水、易溶于乙醇等有机溶剂。香茅精油具有抗炎、抗氧化的生物活性，同时具有抑菌和杀菌活性[9-10]。本研究在对红螯螯虾气单胞菌分离的基础上，进行香茅精油对维氏气单胞菌的抑菌研究，以期为香茅精油或香茅防治水产养殖细菌疾病提供参考。1材料与方法1.1试验材料红螯螯虾（red claw）于2020年7月取自漳州漳浦石榴螯虾养殖基地，具有消化道明显变粗、肠道异常、肠胃空、有液体或黄色脓状物症状。柠檬香茅精油为本实验室通过蒸馏法获得。柠檬香茅种植于福建省农业科学院亚热带农业研究所；爪哇香茅精油由柬埔寨亢品农业发展公司提供。试验试剂：TSA、TSB培养基购自广州环凯微生物科技有限公司；2×Ex Taq PCR预混液、Taq酶购自福州瑞真技术有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成；试验用其他试剂所国产分析纯。试验仪器：日本电子（JEOL）JSM-6380LV扫描电镜、美国Life Technologies VERITI PCR仪、美国UVP凝胶成像系统、上海一恒MJ-250-Ⅱ型培养箱、上海一恒THZ-300C恒温培养摇床。1.2试验方法1.2.1气单胞菌的分离病虾于当天取样，低温冷藏快速送至实验室，无菌水清洗3次；在超净台内使用无菌镊子对螯虾肠道取样，肠道使用无菌水清洗3次，将肠容物使用无菌水稀释均匀涂布于胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）上，28 ℃恒温培养24 h，挑取典型单菌落，溶于200 μL灭菌生理盐水，接种纯化3次，菌悬液加20％甘油，-80 ℃保存，备用。1.2.216S rDNA检测鉴定将分离的维氏气单胞菌菌株命名RC-1。将菌株在TSA平板上活化，挑取单菌落，使用100 μL的灭菌水稀释，作为反应模板，PCR扩增采用16S rDNA通用引物，正向引物5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，扩增目的片段预期为1 500 bp。PCR反应体系为25 μL：模板2.0 μL、正反向引物各1 μL、Taq Master Mix 11 μL、无菌水10 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR产物回收送上海生工生物工程有限公司测序。将测序结果GeneBank Blast检索进行比对分析，应用Mega 6.0邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。1.2.3最小抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）的测定采用二倍梯度稀释法测定最小抑菌浓度[11]，将精油使用50%的无水乙醇溶解混匀，至终浓度100 g/L，取5 mL的无菌EP管，第1管加入3.8 mL TSA培养基，加入香茅精油至终浓度为5 g/L，第2管吸取2 mL，TSA培养基稀释1倍，以此类推，至第5管。加入20 μL维氏气单胞菌菌液，以加无菌水的为空白对照，28 ℃振荡培养24 h，观察EP管中的液体浑浊情况，液体轻摇，澄清，表示无菌生长，如轻摇后有浑浊情况，说明菌体有生长。以澄清的EP管以下不再发生明显浑浊，这一试管的精油浓度即为MIC。将高于MIC的菌液吸取100 μL转接到TSA平板上，涂布，继续培养24 h，观察菌落生长情况，以无菌落生长的精油浓度为MBC。1.2.4细菌形态扫描电镜观察将精油加入待测菌株的过夜培养基中，终浓度为1×MIC，以不加精油为对照组，28 ℃，180 r/min培养1 h，吸取各处理菌液1 mL，4 000 r/min离心10 min，收集菌体，菌体使用PBS清洗3次，使用2.5%戊二醛固定样品4 h；磷酸缓冲液清洗样品3次，每次间隔10~15 min；1%锇酸固定4 h，蒸馏水清洗3次，每次间隔10~15 min，50%、70%、80%、90%、100%酒精逐级脱水，每遍间隔10~15 min，其中100%酒精置换3次，环氧丙烷置换2次，临界点干燥，喷金，上机观察，拍照。2结果与分析2.1菌株形态特性及镜检观察将维氏气单胞菌接种于TSA培养上培养24 h，菌落成圆形、中央微隆、边缘齐整、浅黄色；镜检观察其菌体形状为短杆状、两端钝圆。2.2维氏气单胞菌16S rDNA基因的克隆（见图1）菌液PCR检测获得阳性克隆。由图1可知，目的片段大小为1 486 bp。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.022.F001图1菌株RC-1 16S rDNA电泳检测注：M为Marker；1~3为维氏气单胞菌16S rDNA基因电泳条带。2.316S rDNA基因序列分析及系统发育树构建（见图2）菌株RC-1的16S rDNA序列长度为1 438 bp（GenBank登录号为：MW555245），在NCBI中进行Blast同源性检索，发现其16S rDNA序列与维氏气单胞菌的同源性最高（98.82%）。选取不同气单胞菌属的代表株16S rDNA序列构建系统发育树。由图2可知，菌株RC-1与维氏气单胞菌聚为一支。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.022.F002图2基于MW555245 RC-1序列构建的气单胞菌的NJ树2.4香茅精油MIC、MBC测定结果（见表1）由表1可知，柠檬香茅精油的MIC为0.625 0 g/L，爪哇香茅精油的MIC为1.250 0 g/L，加同等浓度的无菌水处理CK和加50%的酒精溶剂的处理，菌均有生长，对维氏气单胞菌的生长无影响。将高于MIC值浓度的菌液吸取100 μL转接至TSB平板上，涂布均匀，培养24 h，观察菌落生长情况。结果表明，柠檬香茅精油的MBC为1.250 0 g/L，爪哇香茅精油的MBC为2.500 0 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.022.T001表1香茅精油对维氏气单胞菌的最小抑菌浓度组别柠檬香茅精油爪哇香茅精油对照++5.000 0 g/L--2.500 0 g/L--1.250 0 g/L--0.625 0 g/L-+0.312 5 g/L++50%酒精++注：“+”为有菌生长，“-”为无菌生长。2.5精油处理后维氏气单胞菌的扫描电镜检测（见图3）由表3可知，未加精油处理的维氏气单胞菌呈短杆状、两端钝圆、细菌表面光滑、菌体结构完整；经1×MIC浓度的精油处理，细胞膜出现破裂、菌体明显凹陷、胞内物溢出。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.022.F003图3香茅精油处理维氏气单胞菌扫描电子显微镜图（×10 000）3讨论本试验从红螯螯虾的肠道中分离出菌株MW555245，根据镜检形态学观察为短杆状、两端钝圆的菌株，16S rDNA序列与NCBI收录的维氏气单胞菌最为接近，系统发育分析与维氏气单胞菌聚为一支，因此将该菌株鉴定为维氏气单胞菌。近年来，酸化剂、微生态制剂、中草药添加剂、植物精油合剂、抗菌肽等作为抗生素的替代产品在杀菌抑菌方面的研究较多[12]。植物精油在水产动物养殖中，如肉桂醛、百里香酚和香芹酚对导致腐败的黄杆菌和弧菌科微生物有抑菌作用，肉桂醛、柠檬醛、柠檬草、山苍子油对大黄鱼的特定腐败菌有显著抑制作用[13]。植物精油的抑菌机制是通过破坏细胞质膜的完整性来使细菌性病原体致死，细胞质膜的破坏进一步会引起内环境pH值和无机离子的失衡，导致质子原动力的衰竭和ATP的损耗，且针对革兰氏阴性菌更有效[14]。水产养殖中的细菌性病害和抗生素残留是制约养殖业绿色可持续发展的重要因素，安全有效且环境友好的抗菌制剂的使用或进行饲料添加用于病害的防控是水产养殖中的研究热点。4结论本研究从红螯螯虾分离到的病原菌为维氏气单胞菌（GenBank登录号：MW555245）。柠檬香茅精油的MIC为0.625 0 g/L，MBC的1.250 0 g/L；爪哇香茅油的MIC为1.250 0 g/L，MBC的2.500 0 g/L。香茅精油可以破坏维氏气单胞菌的细胞膜，香茅精油可应用于水产养殖中病菌防控或饲料添加。