哺乳动物乳汁成分主要受到年龄、季节、食物以及个体差异等因素影响。乳汁中含有水、蛋白质、无机盐、脂肪、糖、维生素等营养成分。乳汁中营养成分的含量取决于其通过上皮细胞的转移速度和该物质在血浆中的半衰期[1]。乳汁的合成主要由两部分组成，分别为乳腺细胞内的合成和血液摄取。乳蛋白、乳脂和乳糖主要在乳腺细胞内合成，血液供给的游离氨基酸是合成乳蛋白质的原料，包括乳蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；乳糖由血液中携带的葡萄糖形成半乳糖后合成；乳脂的合成大部分源自血浆中呈乳糜微粒状态的甘油三酯，也有一部分源自脂蛋白的降解。一些微量元素如免疫球蛋白、矿物质、无机盐、维生素、激素等主要从血浆中摄取。催乳素（PRL）是雌性动物乳腺生长发育、启动和维持泌乳必不可少的激素。在妊娠期间，PRL与雌激素（E2）、甲状腺激素（P4）协同促进乳腺进一步发育，此期间P4含量较高，会竞争性抑制PRL与催乳素受体（PRLR）结合，从而减弱PRL的泌乳作用[2]。分娩后E2和P4浓度降低，PRL促进并维持泌乳。在乳腺中，PRL发挥作用主要通过JAK/Stat信号通路调控乳蛋白的表达，PRL与PRLR以1∶2结合形成复合体，在被酪氨酸激酶残基磷酸化后，与Stat5蛋白形成复合体转移到细胞核内，后与靶基因（如乳蛋白基因）启动子中的特定调控位点结合激活基因转录[3-4]。PRL也能够通过激活PI3K从而磷酸化mTORC2调控乳蛋白的合成[5]。哺乳动物靶点西罗莫司（mTOR）存在两个功能和结构不同的复合物，mTORC1和mTORC2[6]，哺乳动物mTORC1的核心成分主要有RAPTOR（mTOR的调控相关蛋白）和mLST8（哺乳动物致死蛋白）；mTORC1被生长因子（激素）、营养物质（氨基酸）和细胞能量状态（高ATP/ADP比值）激活[7-8]。而mTORC2只能被生长因子激活，而且这种激活模式是通过PI3K依赖的mTORC2核糖体所介导的[5]。不同产奶量奶牛血清中激素水平存在一定的差异，奶牛泌乳量及乳蛋白合成与血清中激素水平密切相关。催乳素作为重要的泌乳相关激素，其调控奶牛乳成分合成的适宜水平与机制的研究报道较少。因此，本试验研究催乳素对BMECs增殖、酪蛋白合成的影响，并从mTOR和JAK2-STAT5通路关键信号分子转录水平初步阐释了其作用机制，旨在为调控奶牛乳成分合成提供参考。1材料与方法1.1试验材料DMEM/F12（12491-015）和葡萄糖（A2494001）均购自美国Gibco公司；氢化可的松（H0135）、胶原酶Ⅱ（17101-015）、青-链霉（15140-122）、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）（25200072）体，均购自Gibco公司；催乳素（CYT-240）购自以色列ProsPec公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）（298-93-1）购自美国AMRESCO公司；胰岛素转铁蛋白溶液（ITS）（41400045）、胎牛血清（FBS）（SH30084.03）、PBS（SH30256.01）购自美国Hyclone公司；总RNA提取试剂盒和实时定量PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司；75 cm2细胞培养瓶（430720）、6孔培养板、96孔板，均购自Corning公司。1.2试验设计以健康状况良好的中国荷斯坦奶牛乳腺为试验材料，在实验室中分离乳腺组织，取P3代纯化后的细胞接种于细胞培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中，待生长汇合至约80%时，使用饥饿培养基（不含血清、激素）饥饿培养16 h，更换含不同浓度（0、100、200、400和800 μg/L）催乳素的诱导培养基继续培养24 h，收集细胞。采用MTT法检测细胞活力，采用实时定量PCR法检测酪蛋白（CSN1S1、CSN2和CSN3）、酪蛋白合成相关通路（PI3K-AKT-mTOR、AMPK-mTOR、JAK2-STAT5）以及葡萄糖转运载体相关基因（GLUT1、GLUT8、GLUT12）表达，各基因表达量用2-△△Ct值计算[9]。1.3测定指标及方法1.3.1乳腺细胞获取及纯化选用生长状况良好的荷斯坦奶牛，取奶牛乳腺组织中无菌且适宜组织50 g，加入适Ⅱ型胶原酶消化原代细胞。原代细胞生长至密度为70%~80%时，利用胰蛋白酶耐受性不同的特性，将BMECs与成纤维细胞分离，并纯化传代到P1代冻存，备用。1.3.2BMECs活力检测细胞活力的检测采用MTT法。96孔板中每孔接种1×104的BMECs，将96孔板放入5% CO2、37 ℃的恒温培养箱中，培养至细胞汇合80%，弃去上清，添加饥饿培养基，饥饿16 h，更换含有不同浓度雌激素的DMEM/F12培养基继续培养24 h，本试验每个催乳素处理组设5个重复，一个培养孔为一个重复；培养20 h，每孔加入5 μL浓度为5 g/L的MTT；继续培养4 h。取出96孔板，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100~200 μL，振荡10 min，在490 nm处测定吸光度（OD）。细胞相对增殖率(RGR)=试验组OD490 nm/对照组OD490 nm (1)1.3.3BMECs乳蛋白合成相关基因的表达量测定选取纯化后的P2代细胞传入培养瓶中，细胞贴壁生长至80%左右汇合时，弃去培养基，添加饥饿培养基培养16 h，更换催乳素诱导培养基继续培养24 h，使用胰蛋白酶消化法消化细胞于离心管中并进行细胞收集。细胞中提取总RNA，按照TaKaRa RNA提取试剂盒进行，反转录按照TaKaRa反转录试剂盒进行。本试验内参基因选用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、肌动蛋白（β-actin）和泛素表达转录因子（UXT），引物序列及参数见表1。试验分析每组设3个重复。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.018.T001表1引物序列及参数基因序列（5'→3'）GenBank登录号甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）F：5'-GTTTGTGATGGGCGTGAAC-3'R：5'-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'XM-001034034.1β－肌动蛋白（β-actin）F：5'-GCCATGAAGCTGAAGATGAC-3'R：5'-CCTTCTGCAGCTCAGATATG-3'NM-173979泛素表达转录因子（UXT）F：5'-CAGCTGGCCAAATACCTTCAA-3'R：5'-GTGTCTGGGACCACTGTGTCAA-3'NM-005163αS1-酪蛋白（CSN1S1）F：5'-TTCCCTCTTTCATACTGTGAAGTCGT-3'R：5'-GGCTATGGCTCCTAAGCACA-3'NM_181029.2κ-酪蛋白（CSN3）F：5'-CCAGCTGCAGTTAGGTCAC-3'R：5'-GGTGGAATGGCCATAAATGAT-3'NM_174294.蛋白激酶B（AKT）F：5'-CCTGCTCTCTGGGCTACTCAA-3'R：5'-CACGATGCTGGCGAAGAA-3'NM_005163哺乳动物西罗莫司靶蛋白（mTOR）F：5'-TGTGGAGTTTGAGGTGAAGC-3'R：5'-ATTATCAAAGAAGGGCTGCAC-3'XM_002694043.1真核翻译起始因子4E结合蛋白（4EBP1）F：5'-GAACTCACCTGTGACCAAGA-3'R：5'-CTCAAACTGTGACTCTTCACC-3'BC120290.1核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）F：5'-ATGAAAGCATGGACCATGGG-3'R：5'-CCGGTATTTGCTCCTGTTAC-3'NM- 205816.1真核翻译起始因子4E（eIF4E）F：5'-GAAGACTTTTGGGCTCTGTAC-3'R：5-'CAGCTCCACATACATCATCAC-3'NM-174310.3催乳素受体（PRLR）F：5'-GATGACTGTGAGGACCCAGCA-3'R：5'-AAGGCCATGTGGAAGATTTG-3'NM_1741551.3.4BMECs酪蛋白合成量的测定培养结束后添加100 μL含有0.1%PMSF的RIPA细胞裂解液，细胞裂解后按照5∶1的体积比混合目的蛋白样品于上样缓冲液，沸水浴5 min使蛋白样品充分变形，室温降温。将样品点入凝胶样品孔中，电泳。电泳结束后转膜，根据目的蛋白的分子量大小，选择合适的PVDF膜。转膜结束后用TBST洗膜（10 min，3次）进行封闭，1~2 h。4 ℃过夜，一抗孵育选择兔抗多克隆抗体（1∶1 000）。一抗孵育结束后洗膜（10 min，3次），进行二抗孵育（1∶10 000）1.0~1.5 h。显影按照ECL发光试剂盒说明书进行，最后在蛋白成像仪上显影拍照。采用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值。1.4数据统计与分析采用Excel 2007软件整理和计算数据，RT-qPCR试验结果采用2－△△Ct法进行相对定量分析。利用SPSS 19软件的One-way ANOVA程序对数据进行单因素方差分析，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1催乳素对BMECs增值率的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，催乳素可以增加BMECs的增值率，其中100、200 μg/L组BMECs增值率显著增加（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.018.T002表2催乳素对BMECs增殖率的影响项目RGR对照组1.00c100 μg/L组1.33a200 μg/L组1.22ab400 μg/L组1.10bc800 μg/L组0.97cSEM值0.039P值0.000 12.2催乳素对BMECs酪蛋白基因表达的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，100、200、400 μg/L催乳素均能够上调CSN1S1、CSN2、CSN3基因表达，其中100、200 μg/L催乳素显著上调CSN1S1和CSN3的基因表达（P0.05），100、200、400 μg/L催乳素显著上调CSN2基因表达（P0.05）；800 μg/L催乳素显著下调CSN3基因表达（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.018.T003表3催乳素对BMECs酪蛋白基因表达的影响项目CSN1S1CSN2CSN3对照组1.00bc1.00d1.00c100 μg/L组1.44a2.02c1.63b200 μg/L组1.71a3.34a3.28a400 μg/L组1.37ab2.52b1.05c800 μg/L组0.94c0.95d0.70dSEM值0.0870.2450.248P值0.003 00.000 10.000 12.3催乳素对BMECs酪蛋白合成相关通路基因表达的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，100、200、400 μg/L催乳素可以显著上调AMPK、AKT、S6K1的基因表达（P0.05）；100、200 μg/L催乳素可以显著上调mTOR基因表达（P0.05）；各催乳素组4EBP1基因表达均显著降低（P0.05）；200 μg/L催乳素可以显著上调eIF4E基因表达（P0.05），800 μg/L催乳素可以显著下调eIF4E基因表达（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.018.T004表4催乳素对BMECs酪蛋白合成相关通路基因表达的影响项目AMPKAKTmTORS6K14EBP1eIF4E对照组1.00c1.00c1.00cd1.00c1.00a1.00bc100 μg/L组1.73b1.29b3.78a1.44b0.80c1.40b200 μg/L组2.40a2.60a3.23b2.78a0.84c1.90a400 μg/L组2.56a1.50b1.19c1.61b0.92b0.89c800 μg/L组0.96c0.76c0.81d1.08c0.71d0.43dSEM值0.1810.1720.3340.1740.0280.141P值0.000 80.000 10.000 10.001 30.000 20.001 82.4催乳素对BMECs酪蛋白表达量的影响（见表5、图1）由表5可知，与对照组相比，100、200、400 μg/L催乳素可以显著增加α-酪蛋白表达量（P0.05）。100、200 μg/L催乳素可以显著增加β-酪蛋白表达（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.018.T005表5催乳素对BMECs酪蛋白表达量的影响项目α酪蛋白β酪蛋白对照组0.77c0.86b100 μg/L组1.07b1.06a200 μg/L组1.32a1.12a400 μg/L组1.08b0.97ab800 μg/L组0.78c0.83bSEM值0.0590.036P值0.000 10.017 010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.018.F001图1催乳素对BMECs酪蛋白表达量的影响3讨论3.1催乳素对BMECs增殖的影响PRL是1种由垂体前叶催乳激素细胞分泌的多肽激素。PRL参与生殖、水电解质平衡、生长发育、免疫功能、细胞增殖分化以及内分泌代谢功能[10]。青春期前的乳腺发育通过生长激素（GH）、雌激素（E）和生长因子，如胰岛素样生长因子（IGF-I）的联合作用来控制[11]。有研究表明，乳腺癌细胞系能够分泌一定的PRL来促进乳腺癌细胞的增殖[12]。妊娠期间奶牛乳腺快速发育，生长激素、雌激素、黄体酮、催乳素等激素刺激乳腺上皮细胞增殖，随后形成成熟的肺泡[13]。PRL的大部分生物学功能通过PRLR激活的细胞内信号通路发挥，包括JAK-STAT和MAPK-ERK1/2信号通路等[14]。在癌细胞中，PRL通过与PRLR的相互作用促进乳腺癌和前列腺癌的进展；在乳腺癌细胞T47D中，PRL的分泌增加，PRLR蛋白水平降低，细胞增殖减少[12]。本试验结果表明，添加一定剂量的催乳素能够显著增加BMECs的增殖率，高浓度催乳素可以抑制BMECs增殖。一定剂量的催乳素可以显著促进PRLR的基因表达。3.2催乳素对BMECs酪蛋白基因表达的影响催乳素可以调控机体内乳腺发育和泌乳、性腺发育、机体免疫反应和细胞增殖等多项生理功能。PRL通过循环系统，旁分泌或自分泌方式在动物机体内各种生理活动中发挥内分泌调节器的作用。PRL能够促进乳腺小叶泡的生长、分化，进而促进乳腺生长发育，并发动并维持泌乳[15-18]。催乳素在促进反刍动物泌乳功能反面一直存在争议。有研究表明，PRL能够促进奶牛的泌乳[19]，喹高利特可以通过抑制催乳素的分泌降低奶牛的产奶量[20]，注射多巴胺拮抗剂可以增加体内PRL含量，提高奶牛产奶量[21]。本课题组对催乳素调控酪蛋白合成有一定的研究，但催乳素在翻译水平上对酪蛋白合成的影响还不够完善。结果表明，催乳素能够通过PI3K-AKT-mTOR号通路直接调控酪蛋白的合成，大鼠肌肉注射LY294002（PI3K激酶选择性抑制剂）会诱发大鼠细胞凋亡，下调mTOR、J通路中相关基因和激素受体的基因表达，减少酪蛋白表达[22]。本研究结果显示，200 μg/L催乳素可以显著上调AKT、mTOR、S6K1、eIF4E、CSN1S1、CSN2、CSN3的基因表达，当催乳素含量增加至800 μg/L时，CSN1S1、CSN2、CSN3、AKT、mTOR、eIF4E的基因表达低于对照组。试验结果表明，适宜的催乳素能够通过激活mTOR、JAK-STAT信号通路促进酪蛋白的基因表达，但随着含量增加，酪蛋白基因表达逐渐缓慢，催乳素含量达到800 μg/L时，酪蛋白的基因表达被抑制。3.3催乳素对BMECs酪蛋白表达的影响酪蛋白是牛奶中的分泌蛋白，是哺乳期犊牛必需氨基酸和钙的主要来源[23]。酪蛋白在分娩前后大量表达，并在哺乳期的肺泡细胞中持续供给[24]。催乳素、糖皮质激素在分娩前后分泌增加，调节乳蛋白中β-酪蛋白的表达[25]。有研究表明，PRL能够在翻译水平上促进β-酪蛋白的表达[26-28]。体外培养乳腺上皮细胞时，添加催乳素可以促进β-酪蛋白的表达及分泌[29]。葡萄糖调节蛋白能够刺激PRL、E2的表达，通过mTOR信号通路在翻译水平上促进酪蛋白的生成[30]。添加葡萄糖能够促进BMECs在翻译水平上对乳蛋白的调控[31]。但是催乳素调控奶牛乳腺上皮细胞如何通过mTOR信号通路增加酪蛋白的合成的机理以及催乳素的最佳剂量还尚不明确。在本研究中，与对照组相比，100 μg/L催乳素可以显著上调CSN1S1、CSN2、CSN3、AKT、mTOR、S6K1的基因表达，显著增加BMECs中α-酪蛋白和β-酪蛋白的表达量。结果表明，添加催乳素能够激活mTOR信号通路，促进mTOR信号通路下游的效应蛋白S6K1表达，从而在转录、翻译水平调控3种酪蛋白基因的表达。4结论100~400 μg/L催乳素可以促进BMECs增殖。200 μg/L催乳素对BMECs酪蛋白合成相关基因表达具有较好的促进效果。200 μg/L催乳素在转录水平上对促进酪蛋白表达效果最好；100 μg/L催乳素在翻译水平上对促进酪蛋白合成效果最好。