畜禽养殖业是国民经济的重要组成部分[1]。在饲料中添加抗生素可以提高养殖效率，但抗生素会导致动物肠道微生物失衡[2]，产生耐药菌株[3]，对动物和人体健康非常不利[4]。近年来，随着我国饲料全面禁止抗生素的政策落实，饲料业和畜牧业急需寻找绿色无污染的新型饲料添加剂[5-6]。微生物饲料添加剂为发展绿色饲料开辟了新途径[7]。目前，饲料添加剂中益生菌种类日益增多，其中芽孢杆菌在饲料业中应用较为广泛[8]。蜡样芽孢杆菌在饲料中应用效果较好[9-11]，能够改善动物的生长性能[12]，增强免疫反应和抗病能力[13]，抑制有害菌生长。蜡样芽孢杆菌含有产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶，具有很多生物学活性[14-16]。目前，蜡样芽孢杆菌已在欧盟被批准用作母猪、仔猪等动物的益生菌饲料添加剂[17]。研究发现，蜡样芽孢杆菌作为饲料添加剂在生产过程中具有许多优势，如耐高温、抗酸碱的生物特性，有利于饲料加工生产，降低加工成本[18]。本试验从猪场新鲜粪便中获得1株蜡样芽孢杆菌疑似菌株，进行分子生物学鉴定和生理生化鉴定，并探究其生物学功能，为新型绿色微生物饲料的发展提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验粪便试验粪便采自河南省济源市猪场，为30 d内未饲喂过抗生素和益生菌的猪的新鲜污染粪便。1.1.2试剂与培养基蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂粉等均为国产分析纯试剂；蜡样芽孢杆菌显色平板购自青岛海博生物公司；DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司提供；Mix酶、引物1、引物2等购自华大基因；API生理生化鉴定试剂盒购自梅里埃生物公司。营养琼脂培养基：蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%、琼脂粉2%，121 ℃灭菌20 min。蛋白酶检测培养基：脱脂奶粉5%、酵母粉1%、琼脂粉2%，115 ℃灭菌15 min。淀粉酶检测培养基：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化钠0.5%、琼脂粉2%、可溶性淀粉0.2%，121 ℃灭菌20 min。蛋白酶产酶培养基：玉米粉2%、麸皮3%、豆饼粉3%、磷酸氢二钾0.04%、磷酸氢二钠0.3%、氯化锌0.1%，121 ℃灭菌20 min。淀粉酶产酶培养基：蛋白胨1%、淀粉2%、磷酸二氢钾0.1%、氯化钠0.5%、硫酸亚铁0.005%、氯化钙0.05%、硫酸镁0.05%，121 ℃灭菌20 min。1.1.3试验仪器DNP-9082恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、Axio Image M2全自动正置荧光显微镜（德国zeiss公司）、QYC2012C控温摇床（上海福玛设备公司）、Thermoblock PCR扩增仪（德国Biometra设备公司）、DYY6C电泳仪（北京六一仪器厂）、Bio-Rad分子成像仪（美国Bio-Rad公司）、超微量蛋白核酸分析仪（美国赛默飞公司）、梅里埃ATB自动化微生物鉴定与药敏检测系统（梅里埃生物公司）。1.2试验方法1.2.1样品采集采集时间选择猪排泄的高峰时段，样品采用无菌容器收集，去除前端粪便，采集中间粪便利用无菌袋收集，立刻放于冰盒中冷冻保存，尽快送回实验室。1.2.2菌种筛选纯化称取1 g猪场新鲜粪便于10 mL无菌生理盐水中，利用涡旋器混匀，8 000 r/min离心5 min，取上清，使用无菌生理盐水依次稀释成10-1、10-3、10-5、10-7浓度梯度，将灭菌冷却至约60 ℃的营养琼脂培养基倒入灭菌平板，分别吸取0.1 mL进行涂布营养琼脂平板，37 ℃培养48 h，根据不同形态特征挑取单菌落进行重新划线培养，将疑似蜡样芽孢杆菌菌株挑出保存。1.2.3外观形态鉴定保存的蜡样芽孢杆菌疑似菌株挑取单菌落，分别接种于营养琼脂平板和蜡样芽孢杆菌显色平板培养，观察菌落外观、形态、颜色等，并对疑似菌株进行革兰氏染色。1.2.4生理生化鉴定利用梅里埃API鉴定试剂盒和自动化微生物鉴定与药敏检测系统对分离菌株进行鉴定。1.2.5分子生物学鉴定将分离到的目标菌株接种于LB液体培养基中37 ℃培养过夜，使用DNA提取试剂盒对目标菌株DNA进行提取，利用超微量蛋白核酸分析仪在260 nm处对提取DNA质量进行检验，对合格DNA进行PCR扩增。扩增条件：94 ℃预变性4 min、94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃终延伸5 min。扩增完成后进行测序，将与模式菌株比对。1.2.6生物学功能研究1.2.6.1淀粉酶功能将筛选得到的蜡样芽孢杆菌点接淀粉酶检测培养基平板，37 ℃培养3 d，滴加卢氏碘液，使碘液覆盖整个平板，观察到菌落周围是否出现透明圈。挑取单菌落接种于淀粉酶产酶培养基，37 ℃，180 r/min摇瓶培养72 h，离心取上清，淀粉酶活力测定参照GB/T 24401—2009。1.2.6.2蛋白酶功能将筛选得到的蜡样芽孢杆菌点接蛋白酶检测培养基平板，37 ℃培养3 d，观察菌落周围是否出现透明圈。挑取单菌落接种于蛋白酶产酶培养基，37 ℃，180 r/min摇瓶培养72 h，离心取上清，蛋白酶活力测定参照GB/T 23527—2009的方法。2结果与分析2.1菌株分离纯化结果（见图1）从猪场新鲜粪便中分离得到1株特征明显的蜡样芽孢杆菌疑似菌株，编号W21-B5。由图1（a）可知，营养琼脂平板上菌落呈乳白色、较大、边缘不整齐。由图1（b）可知，利用蜡样芽孢杆菌显色平板培养后，菌落为蓝绿色，菌落周围有一不透明圈。由图1（c）可知，革兰氏染色为阳性菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.020.F001图1菌株外观形态2.2W21-B5的生理生化鉴定结果（见表1、表2）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.020.T003编号测定的酶底物结果9胰蛋白酶N-苯甲酰-DL-精酰胺-2-萘胺+10胰凝乳蛋白酶N-戊二酰-苯基丙氨酸2-萘胺+11酸性磷酸酶N-萘基-磷酸盐+12苯酚-AS-BI-磷酸水解酶萘酚-AS-BI-磷酸盐+13α-半乳糖苷酶6-溴-2-萘基-α-D-半乳糖吡喃糖苷-14β-半乳糖苷酶2-萘基-β-D-半乳糖吡喃糖苷-15β-糖醛酸苷酶萘酚-AS-β-D-糖醛酸苷-16α-葡萄糖苷酶2-萘基-α-D-吡喃葡萄糖苷+17β-葡萄糖苷酶6溴-2-萘基-β-D-吡喃葡萄糖苷+18N-乙酰-葡萄糖胺酶1-萘基-N-乙酰-βD葡萄糖胺-19α-甘露糖苷酶6-溴-2-萘基-α-D-吡喃甘露糖苷-20β-岩藻糖苷酶2-萘基-α-L-吡喃果糖苷-利用梅里埃API 50CHB和API ZYM试剂盒对目标菌株进行生理生化鉴定。由表1可知，菌株能够利用D-核糖、D-葡萄糖、D-果糖、N-乙酰葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵柠檬酸铁、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-海藻糖、淀粉、糖原作为碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.020.T001表1API 50CHB结果管号试验代码底物成分结果管号试验代码底物成分结果0--阴性对照-25ESC七叶灵柠檬酸铁+1GLY丙三醇-26SAL水杨苷+2ERY赤藻糖醇-27CELD-纤维二糖+3DARAD-阿拉伯糖-28MALD-麦芽糖+4LARAL-阿拉伯糖-29LACD-乳糖-5RIBD-核糖+30MELD-蜜二糖-6DXYLD-木糖-31SACD-蔗糖-7LXYLL-木糖-32TRED-海藻糖+8ADOD-核糖醇-33INU菊粉-9MDX甲基-β-D-吡喃木糖苷-34MLZD-松三糖-10GALD-半乳糖-35RAFD-棉子糖-11GLUD-葡萄糖+36AMD淀粉+12FRUD-果糖+37GLYG糖原+13MNED-甘露糖-38XLT木糖醇-14SBEL-山梨糖-39GEND-龙胆二糖-15RHAL-鼠李糖-40TURD-土伦糖-16DUL卫矛醇-41LYXD-来苏糖-17INO肌醇-42TAGD-塔格糖-18MAND-甘露醇-43DFUCD-岩藻糖-19SOB山梨醇-44LFUCL-岩藻糖-20MDM甲基-α-D-吡喃甘露糖苷-45DARLD-阿拉伯醇-21MDG甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷-46LARLL-阿拉伯醇-22NAGN-乙酰葡萄糖胺+47GNT葡萄糖酸钾-23AMY苦杏仁苷-482KG2-酮基葡萄糖酸钾-24ARB熊果苷+495KG5-酮基葡萄糖酸钾-注：+表示阳性，-表示阴性；下表同。由表2可知，通过API ZYM试剂盒测定目标菌株产酶活性，发现其具有碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂酯酶、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、苯酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶活性。经过自动化微生物鉴定与药敏检测系统鉴定97%可能为蜡样芽孢杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.020.T002表2API ZYM结果编号测定的酶底物结果1对照阴性对照-2碱性磷酸盐酶2-萘基磷酸盐+3酯酶2-萘基丁酸盐+4类脂酯酶2-萘基辛酸盐+5类脂酶2-萘基豆蔻酸盐-6白氨酸芳胺酶L-白氨酰-2-萘胺+7缬氨酸芳胺酶L-缬氨酰-2-萘胺+8胱氨酸芳胺酶L-胱氨酰-2-萘胺+续表2　API ZYM结果2.3W21-B5的分子生物学鉴定结果（见图2、图3）对目标菌株提取DNA，利用通用引物1（27F）和引物2（1492R）对其进行PCR扩增。由图2可知，扩增片段为1 481 bp。将16S rDNA序列输入PUBMED BLAST网站分析并与模式菌株Bacillus cereus比对同源性达到99.12%，结合此菌株的外观形态特征、显色平板培养结果及生理生化结果，鉴定该菌为蜡样芽孢杆菌，命名为W21-B5。通过MEGA 7.0软件对该菌株构建系统发育进化树。由图3可知，该菌株和与蜡样芽孢杆菌的同源性较近。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.020.F002图2PCR产物电泳图注：M 为DL2 000 plus ladder，W21-B5为蜡样芽孢杆菌16S rDNA 基因。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.020.F003图3蜡样芽孢杆菌系统发育进化树2.4W21-B5的生物学功能研究（见图4）将筛选得到蜡样芽孢杆菌点接淀粉酶检测培养基平板，对平板处理以后观察到菌落周围出现透明圈。由图4（a）可知，测量透明圈外径和菌落直径，二者比值达到1.6，说明此菌株具有淀粉酶功能。按照国标测定方法对该菌株淀粉酶活力进行测定，酶活力达到1.5 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.020.F004图4W21-B5的生物学功能研究（a）淀粉酶透明圈 （b）蛋白酶透明圈将筛选得到蜡样芽孢杆菌点接蛋白酶检测培养基平板，培养之后观察到菌落周围出现透明圈。由图4（b）可知，通过测量透明圈外径和菌落直径，发现二者比值达到1.2，说明此菌株具有蛋白酶酶功能。按照国标测定方法对该菌株蛋白酶活力进行测定，酶活力达到1.2 U/mL。3讨论饲料业的全面禁抗加速饲料业和畜牧业的转型发展，微生物饲料添加剂能够提高动物免疫力，改善动物肠道菌群平衡，提高动物生产性能，为发展绿色饲料提供保障。肠道中微生物区系组成复杂，添加益生菌会对肠道菌群起很好的调节作用[19]，减少有害菌在肠道的定植[20]。蜡样芽孢杆菌作为其中重要一员，能够发挥重要作用。本试验中，从猪场新鲜粪便中分离得到蜡样芽孢杆菌疑似菌株，通过营养琼脂培养基进一步纯化，结合外观形态、分子生物学结果和生理生化鉴定结果确定其为蜡样芽孢杆菌。此菌株作为微生物饲料添加剂的潜力菌株，能够表现出较强的淀粉酶和蛋白酶活性，可以提高饲料消化转化率，对促进动物生长起到有益作用。4结论通过筛选从猪场新鲜粪便中得到1株具有多种生物功能的蜡样芽孢杆菌W21-B5。该菌株可以作为重要的微生物饲料添加剂，表现出较强的蛋白酶和淀粉酶功能，在饲料应用领域发展潜力巨大。本研究为以后微生态制剂的制备和绿色健康饲料的发展提供参考。