仔猪腹泻是养猪生产中普遍存在的疾病之一，严重影响养猪业的经济效益。据统计，我国30 kg以下的仔猪全年平均发病率达40%，死亡率达10%~15%。其中，由腹泻引起的仔猪死亡数约占死亡总数的40%，每年给养猪业造成的经济损失达数百亿元[1]。蒙脱石分子结构独特，具有良好的吸附性，可以在肠道中吸附大肠杆菌等有害细菌及其代谢的有害产物，起到缓解动物肠道细菌感染的作用。蒙脱石对黄曲霉毒素等有毒物质也有显著的吸附效果[2]。穿心莲内酯是药用植物穿心莲的主要活性成分，具有抗炎、抗菌的功能，穿心莲内酯对于试验性腹泻、结肠炎均具有显著的治疗效果[3-4]。同时，蒙脱石作为良好的药物载体，可以起到良好的载药与释药作用，利于药物的充分吸收[5]。王桂芳等[6]研究发现，蒙脱石对抗肿瘤新药卡莫氟具有较好的缓释作用，是1种性能优异的药物缓释载体。田双艳等[7]以盐酸倍他洛尔为模型药物，制备新型镶嵌蒙脱石载体的载药蒙脱石壳聚糖纳米粒，得到平均包封率36.13%、平均载药量14.50%、10 h累积释放率达82.23%。本研究以蒙脱石为载体，制备穿心莲改性蒙脱石，优化穿心莲改性蒙脱石制备条件参数，并对其结构进行表征，研究其抑菌效果，探究其替代抗生素的可行性，为其进一步在养殖生产中应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料蒙脱石购自内蒙古某膨润土科技有限公司；聚乙二醇PEG1000购自天津科密欧化学试剂有限公司；穿心莲内酯标准品购自上海同田生物技术股份有限公司，纯度98%；穿心莲提取物购自桂林三棱生物科技有限公司，纯度11.63%；产肠毒素型大肠埃希菌（Escherichia coli ETEC，菌种编号：CICC 10667）购自中国微生物菌种保藏管理中心。1.2仪器设备SHIMADZU LC-10AT型高效液相色谱仪（日本岛津）、D8 Advance型X-射线衍射仪（德国Bruker公司）、Spectrum TWO型红外光谱分析仪（美国铂金埃尔默企业管理有限公司）、Q50热重分析仪（美国TA仪器公司）、Quanta 250FEG扫描电子显微镜（捷克FEI公司）、Spark10M酶标仪（瑞士帝肯奥地利有限责任公司）、TDL-5-A飞鸽台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。1.3改性蒙脱石的制备与指标测定利用蒙脱石为原料，制备Na化蒙脱石、PEG复合改性蒙脱石，测定改性蒙脱石的膨胀容、吸蓝量、离子交换容量等指标，由X射线衍射图谱得蒙脱石层间距[8-9]。1.4穿心莲改性蒙脱石条件优化准确称取一定质量的穿心莲提取物于乙醇中超声提取，加入一定体积的蒸馏水，并分别准确称取一定质量的原矿蒙脱石、Na化蒙脱石、PEG复合改性蒙脱石样品于恒温水浴振荡器反应一定时间，离心，洗涤。计算穿心莲内酯结合量及结合率等指标。分别采用最佳反应条件制备穿心莲改性蒙脱石。试验设计方案见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.023.T001表1试验设计方案水平A蒙脱石∶穿心莲B反应时间/hC反应温度/℃D反应pH值110∶10.5405.025∶11.0506.0310∶32.0607.045∶23.0708.052∶14.0809.0610.0711.01.5穿心莲改性蒙脱石的结构表征对制备的穿心莲改性蒙脱石样品在温度范围40~600 ℃、升温速率10 ℃/min条件下进行热重分析，利用傅里叶变换红外光谱进行扫描分析，并在扫描电子显微镜下观察样品表面结构。1.6穿心莲改性蒙脱石对大肠杆菌的抑菌作用研究精确称取0.1 g不同类型蒙脱石于100 mL已灭菌的PBS缓冲液中，吸取100 μL浓度约为108 CFU/mL活化的菌液于缓冲液中，恒温37 ℃振荡2 h，取上层清液，涂布计数。计算蒙脱石对大肠杆菌的吸附率。在不同浓度穿心莲改性蒙脱石培养基中接种大肠杆菌，37 ℃恒温摇床中培养，于第2、4、6和8 h取样，5 000 r/min离心5 min，测定上清液在600、450 nm的吸光度，以此表征大肠杆菌菌体漏出率和培养液的电导率[10]。1.7数据统计与分析数据采用SAS 9.1.3统计软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）及Duncan氏法多重比较，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1改性蒙脱石的物理性能（见表2）由表2可知，与原矿蒙脱石相比，经钠化改性后膨胀容提高5倍，PEG改性蒙脱石提高近10倍，达101 mL/g。钠化改性蒙脱石的离子交换容量提高34.2%，而PEG改性稍有降低。两种改性方法的吸蓝量差异不大，达到40 g/100 g，比原矿蒙脱石提高22%。钠化及PEG改性蒙脱石的分子层间距减小约0.3 nm，PEG改性对比钠化蒙脱石层间距略有提高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.023.T002表2改性蒙脱石的物理性能蒙脱石类型膨胀容/(mL/g)离子交换容量/(mmol/100 g)吸蓝量/(g/100 g)分子层间距d（001）/nm原矿蒙脱石1179.89321.546钠化蒙脱石55107.25391.255PEG有机改性蒙脱石10191.24401.2952.2穿心莲改性蒙脱石制备条件优化3种蒙脱石对穿心莲内酯的吸附量见图1。各因素对穿心莲内脂吸附量的影响见图2。由图1可知，经PEG改性的蒙脱石对穿心莲内酯的吸附作用最强，吸附量达到8.85 mg/g，吸附率达到38.05%。由图2可知，当PEG复合改性蒙脱石与穿心莲提取物质量比为5∶2时，吸附率达36.37%，吸附量趋于饱和。穿心莲内酯与PEG改性蒙脱石作用2 h时吸附结合率最高，反应时间的继续增加，吸附量显著下降。穿心莲内酯与PEG改性蒙脱石作用温度为60 ℃时，吸附结合量最高，为8.00 mg/g。pH值对反应影响显著，在pH值为10.0时获得最大的吸附量，为9.02 mg/g；pH值为11.0时，吸附量迅速降低。采用最佳的反应条件，蒙脱石对穿心莲内酯最大吸附量达到10.33 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.023.F001图13种蒙脱石对穿心莲内酯的吸附量注：*表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.023.F002图2蒙脱石与穿心莲提取物比例、反应时间、温度和pH值对穿心莲内酯吸附的影响2.3穿心莲改性蒙脱石的热稳定性分析不同类型蒙脱石热重分析见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.023.F003图3不同类型蒙脱石热重分析由图3可知，蒙脱石的热重分解大致分为3个阶段，分别是蒙脱石分子层间自由水的蒸发、有机物分子的热分解以及蒙脱石硅酸盐片层羟基的脱除。200 ℃前，4种蒙脱石分子层间水蒸发，质量下降均很快，分别下降9.96%、5.10%、3.73%、3.87%；200~450 ℃，蒙脱石中插层的有机成分发生热分解；366 ℃时，PEG改性蒙脱石的质量下降速率达到高峰，质量下降4.94%；314 ℃时，穿心莲改性蒙脱石质量下降速率达到高峰，质量下降12.03%。硅酸盐片层羟基的脱除发生在450 ℃之后，此阶段质量分数均存在下降趋势。2.4穿心莲改性蒙脱石的结构表征不同类型蒙脱石的红外光谱分析见图4，不同类型蒙脱石的扫描电子显微镜分析见图5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.023.F004图4不同类型蒙脱石的红外光谱分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.023.F005图5不同类型蒙脱石的扫描电子显微镜分析由图4可知，改性后的蒙脱石与未改性的蒙脱石均显示出蒙脱石的主要特征吸收峰，说明这3种改性处理未改变蒙脱石的基本结构。PEG改性蒙脱石在2 789 cm-1处出现亚甲基C—H伸缩振动峰。穿心莲改性蒙脱石在3 397 cm-1出现一个较宽泛的特征峰，此为穿心莲内酯中的—OH的伸缩振动峰[11]，1 650 cm-1附近出现H2O的弯曲振动峰。穿心莲改性蒙脱石在1 727、1 453和1 060 cm-1处的特征峰均出现不同程度的减弱。由图5可知，原矿蒙脱石主要以片状形式及团块集合体存在，颗粒较大、片体较厚，由此推测为钙基蒙脱石[12]。经Na2CO3改性后，蒙脱石颗粒更小、片体更薄，出现很多微小絮状物聚合体。PEG改性使蒙脱石絮状聚合体增多，分子颗粒在形貌上更加柔和，结构更为松散。穿心莲改性蒙脱石在絮状集合体间隙中存在大量类球状颗粒、絮状聚合体增多、轮廓更加突出。2.5穿心莲改性蒙脱石对大肠杆菌抑菌作用的影响（见图6、图7）不同类型蒙脱石对大肠杆菌的吸附率见图6，穿心莲改性蒙脱石对大肠杆菌细菌漏出率及培养液电导率的影响见图7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.023.F006图6不同类型蒙脱石对大肠杆菌的吸附率图7穿心莲改性蒙脱石对大肠杆菌细菌漏出率及培养液电导率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.023.F7a1（a）对大肠杆菌细菌漏出率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.023.F7a2（b）培养液电导率的影响由图6可知，在1 g/L的浓度下，穿心莲改性可以显著提升蒙脱石对于大肠杆菌的吸附率。Na化改性与PEG复合改性蒙脱石均有降低对大肠杆菌的吸附量的趋势，但并未达到显著水平。由图7可知，穿心莲改性蒙脱石对于提高大肠杆菌细菌漏出率和培养液电导率，存在计量上的依赖性趋势，但在前4 h无显著差异（P0.05），在200 g/L的浓度下，第6、8 h时可以显著提高菌体细菌漏出率和电导率（P0.05）。3讨论3.1穿心莲改性蒙脱石的制备蒙脱石改性包括无机改性和有机改性，改性可以提高其物化性质。Na化改性是常用的无机改性方法，可以提高蒙脱石分子中Na+的含量，增强其阳离子性能，有利于离子交换。在此基础上，PEG复合改性蒙脱石可以改善蒙脱石层间的微环境，为蒙脱石作为有机药物载体提供良好的界面。本试验中，PEG改性显著提高蒙脱石对穿心莲内酯的吸附作用。随着穿心莲提取物的增加，穿心莲内酯的吸附量呈上升趋势，当蒙脱石与穿心莲提取物质量比为5∶2时，吸附反应趋于饱和。蒙脱石对穿心莲内酯的吸附率与反应时间呈正相关，可能因为随着穿心莲内酯进入蒙脱石分子层间，其内部空间逐渐展开，更多的穿心莲内酯分子进入晶格内，并在作用2 h时达最大。温度也会影响蒙脱石与穿心莲内酯的结合，提高温度利于蒙脱石层间打开，促进离子交换反应。本试验条件下，反应温度为60 ℃时，蒙脱石对穿心莲内酯的吸附量最高；但温度过高会破坏蒙脱石的离子交换平衡，导致交换容量下降，吸附率降低。蒙脱石表面电荷丰富，改变反应的pH值对穿心莲内酯吸附作用有显著影响。pH值为10.0时，蒙脱石对穿心莲内酯的吸附量最高。溶液pH值大于穿心莲内酯的等电点，会导致穿心莲内酯带负电荷，与带正电荷的改性蒙脱石更容易稳定结合。本试验研究发现，在pH值为10.0时，穿心莲内酯不存在明显的降解现象；但在pH值为11.0时，穿心莲内酯的降解率达45.09%。本试验结果与彭伟文等[13]研究相符，pH值为10.5时，穿心莲内酯开始发生降解。此时，OH-浓度过高，造成上清液中部分穿心莲内酯中酯基开环的水解[14]，故显示为吸附量降低。3.2穿心莲改性蒙脱石的热稳定性分析及其结构表征穿心莲内酯的热稳定性较差，在高温下会生成脱水穿心莲内酯，造成生物活性降低[15]。张守德[16]通过热重分析发现，穿心莲内酯标品在300 ℃左右显著降解。本试验制备的穿心莲改性蒙脱石在200~525 ℃阶段质量下降12.03%，显著高于PEG改性蒙脱石，并在314 ℃时质量下降速率达到高峰，与穿心莲内酯的热稳定性相符合，说明本试验中穿心莲内酯已成功与蒙脱石体结合，穿心莲内酯插层蒙脱石对穿心莲内酯的热稳定性无明显影响。红外图谱显示的蒙脱石特征峰减弱，由于穿心莲内酯已经插入蒙脱石层间，导致蒙脱石层间的Si—O—Si键和Si—O键结合力变弱。通过蒙脱石表面形态的观察，改性处理只改变了蒙脱石的表面形态，并未改变蒙脱石的基本晶型骨架，其中穿心莲改性蒙脱石存在部分类球状颗粒，这是因为穿心莲内酯的加入导致矿物层间疏水性增强，造成蒙脱石片层之间聚合力的变化，再次证明穿心莲内酯相关的有机物质存在于蒙脱石分子体系中。3.3穿心莲改性蒙脱石对大肠杆菌的抑菌效果蒙脱石本身没有抑菌或杀菌作用，对菌体的作用主要是吸附作用，在水溶液可以形成水化悬浮体，形成的“车厢”结构，对细菌起到吸附作用，通过改性处理提高蒙脱石中的阳离子含量，有利于对于表面带有阴离子的细菌产生静电结合[17-18]。蒙脱石插入具有抑菌作用的金属离子或有机物质之后，才具有相对应的抑菌或杀菌作用。穿心莲内酯可以降低大肠杆菌的毒害作用，对大肠杆菌存在显著地抑制作用[19-21]。在本试验条件下，浓度同为1 g/L的Na化改性与PEG改性蒙脱石相比，原矿蒙脱石对大肠杆菌的吸附率有下降趋势，可能因为原矿蒙脱石为钙基蒙脱石，本身含有较高的正电荷以及较大的层间距，易于吸附细菌。但经过穿心莲改性蒙脱石对大肠杆菌吸附率则显著提高，一方面可能是蒙脱石层间距增大，正电荷含量较高，对细菌的吸附能力增强；另一方面穿心莲内酯本身具备破坏细菌表面形态、损伤细菌结构的作用，其促进细菌细胞膜的破坏、胞内蛋白质及胞内离子泄漏，导致细菌死亡。Harshal等[22]通过扫描电子显微镜成像发现，穿心莲内酯对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌存在广谱抗菌性，可以参与细菌细胞膜的破坏，增加细胞膜通透性。试验发现，200 g/L的穿心莲改性蒙脱石可以显著提高大肠杆菌的菌体裂解，菌体胞内电荷Na+、K+等离子溶出，造成细菌培养液电导率提高。其他中药提取物或抑菌剂与蒙脱石结合也得到了相似的结果，如香芹酚和百里香酚负载到蒙脱石上提高了香芹酚和百里香酚的抗菌性能[23]，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）插层蒙脱石对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌也均产生了显著的抑菌效果[24]。因此，蒙脱石作为穿心莲活性成分的载体，在培养液中缓慢释放，起到抑制大肠杆菌的作用。4结论在本试验条件下，穿心莲改性蒙脱石制备的最佳条件为PEG改性蒙脱石与穿心莲提取物质量比5∶2、pH值10.0、60 ℃条件下作用2.0 h，穿心莲内酯最大结合量为10.33 mg/g。制备的穿心莲改性蒙脱石可以显著提高对大肠杆菌的吸附率，促进细菌裂解，具有一定的抑菌作用。