近年来，基于生态保护、市场需求以及养殖收益等因素的考虑，牦牛养殖逐渐从传统放牧向规模化短期育肥模式发展，此过程中普遍采用高精料饲喂。饲喂高精料日粮时，精料会在瘤胃中快速发酵，产生大量挥发性脂肪酸和乳酸，进而引起牦牛的瘤胃酸中毒以及营养代谢疾病的发生，严重时会造成牦牛急性死亡，导致经济效益下降[1-3]。Fernando等[4]研究发现，饲喂高精料日粮可以显著降低肉牛瘤胃拟杆菌的丰度，显著增加绿弯菌和厚壁菌的丰度。体外产气法在反刍动物的瘤胃发酵评价中具有快速和方便等优点。因此，本试验以饲喂高、低精料牦牛作为瘤胃液供体动物，以不同精粗比日粮为发酵底物，利用体外产气法探讨高精料日粮对牦牛的产气量（GP）、体外干物质降解率（IVDMD）及瘤胃发酵参数的影响，以期为牦牛短期育肥产业提供参考。1材料与方法1.1试验设计选用12头健康、体况相近的公牦牛采集瘤胃液，随机分为2组，每组6头，分别饲喂高精料日粮（80∶20，试验组）和低精料日粮（40∶60，对照组）。预试期15 d，正式试验期45 d。发酵底物由精料与燕麦青干草组成，制备前将精料与粗料65 ℃烘干48 h，粉碎并过40目筛，发酵底物日粮精粗比为30∶70（C30组）、50∶50（C50组）及70∶30（C70组）。试验日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.002.T001表1试验日粮组成及营养水平项目C30组C50组C70组原料组成/%燕麦干草70.0050.0030.00玉米13.6122.6831.65小麦3.736.258.87麸皮4.026.439.02菜籽粕3.816.368.71豆粕1.202.173.40棕榈油脂肪粉1.232.112.75食盐0.601.001.40磷酸氢钙0.601.001.40预混料1.202.002.80合计100.00100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)9.7610.9812.15粗蛋白质/%11.0512.4113.23中性洗涤纤维/%45.2437.6729.10酸性洗涤纤维/%28.8323.3217.80钙/%0.420.45047注：1.预混料为每千克日粮提供：Cu 10 mg、Fe 65 mg、Mn 30 mg、Zn 25 mg、I 0.5 mg、Se 0.1 mg、Co 0.1 mg、VA 4 000 IU、VD 500 IU、VE 40 IU。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。试验设计采用2×3双因素交叉组的方法，使用不同精粗比的牦牛瘤胃液和不同精粗比的发酵底物作为试验的2个因素。共6组处理组，分别为A1组（试验组×30∶70）、A2组（试验组×50∶50）、A3组（试验组×70∶30）、B1（对照组×30∶70）、B2（对照组×50∶50）及B3（对照组×70∶30），每组3个重复。1.2试验方法1.2.1瘤胃液采集正式试验期第45 d，晨饲前通过瘤胃管来收集瘤胃液，每只供体牦牛采集瘤胃液约400 mL，将混合物迅速混合，使用4层纱布过滤，装入保温瓶，快速注入CO2并维持厌氧状态，待用。1.2.2瘤胃液体外发酵人工瘤胃缓冲液的制备参照Menke等[5]方法。试验前，准确称取200 mg发酵底物，无损移入100 mL的玻璃注射器中，在注射器活塞表面的前三分之一处，涂抹适量凡士林，防止产气逸出。取30 mL在39 ℃恒温水浴锅预热的混合培养液（瘤胃液∶人工缓缓冲=1∶2），于恒温培养箱39 ℃培养48 h，每个处理组3个重复，设置3个空白对照。在发酵过程中，分别记录2、4、6、8、10、12、18、24、36、48 h各时间点的GP，在测量过程中，产气量超过80 mL时，将气体排出。48 h后，立即使用冰水浴终止发酵，收集发酵底物，使用HANNA HI221型台式酸度计测定其pH值，将发酵液快速装入50 mL离心管中，-80 ℃冷冻，用于其他发酵参数的测定。1.3测定指标及方法1.3.1发酵底物营养成分干物质（DM）、粗蛋白质（CP）、钙（Ca）、磷（P）、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量分别采用GB/T 6435—2014[6]、GB/T 6432—2018[7]、GB/T 6436—2002[8]、GB/T 6437—2002和Van Soest等[9]的方法测定。1.3.2产气量GP(mL)=培养管在某时间点的GP读数-空白管在相应时间点的平均GP的读数 (1)1.3.3干物质降解率干物质降解率=[(发酵前底物干物质含量-发酵后残渣干物质含量)/发酵前底物干物质含量]×100% (1)1.3.4氨态氮（NH3-N）含量参照冯宗慈等[10]的比色法测定48 h发酵液的NH3-N含量。1.3.5挥发性脂肪酸（VFA）含量参考文献[11-13]，使用GC-2014气相色谱仪测定发酵液挥发性脂肪酸（VFA）含量。1.3.6微生物蛋白（MCP）含量参照Cotta等[14]的差速离心法分离出发酵液中的MCP，采用考马斯亮蓝法来测定MCP的含量。1.4数据统计与分析使用SPSS 26.0软件进行统计分析和单因素方差分析，数据结果以平均值和总标准误（SEM）表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1体外发酵48 h不同时间点的GP和产气速率（见图1、表2）由图1可知，B3组在48 h的GP显著高于A1组和B1组（P0.05），A1组最低，为42.72 mL。由表2可知，A3组在2 h的体外发酵产气速率为4.05 mL/h，极显著高于A2组（P0.01），A3组在48 h的产气速率为0.24 mL/h，显著低于A1、A2组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.002.F001图1体外发酵48 h产气量的动态变化注：相同小写字母表示无显著差异（P0.05），不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.002.T002表2体外发酵48 h不同时间点产气速率项目2 h4 h8 h12 h24 h36 h48 hA1组（3∶7）3.47ABab3.07a1.20Bd1.55b0.71Bb0.47Bb0.44aA2组（5∶5）2.78Bb2.69ab1.15Bd2.02ab0.77ABb0.49Bb0.44aA3组（7∶3）4.05Aa3.10a2.27ABbc2.13ab1.00ABab0.66Ab0.24bB1组（3∶7）3.52ABab2.19b1.59Bcd1.37c0.95ABab0.41Bb0.38abB2组（5∶5）3.18ABb2.20b3.00Aab1.92b0.78ABb0.45Bb0.37abB3组（7∶3）3.11ABb2.69ab3.50Aa2.69a1.20Aa0.49Bb0.37abSEM0.1200.1030.2070.1520.0490.020.022P值0.0010.0130.0010.0360.0010.0010.010注：同列数据肩标小写字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05），小写字母不同表示差异显著（P0.05），大写字母不同表示差异极显著（P0.01）；下表同。mL/h2.2体外发酵48 h的体外IVDMD（见表3）由表3可知，B3组的IVDMD最高，极显著高于A1、A3、B1组（P0.01），A1组IVDMD最低，极显著低于A2、B2、B3组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.002.T003表3体外发酵48 h的体外IVDMD项目IVDMDA1组43.30CcA2组51.14ABbA3组48.19BCbB1组47.72BCbcB2组51.49ABbB3组57.13AaSEM0.98P值0.001%2.3体外发酵48 h NH3-N和MCP含量（见表4）由表4可知，A3组、B1组发酵液的NH3-N含量显著高于A1组（P0.05），B1组最高，为171.8 mg/L，A1组最低，为139.4 mg/L。各组发酵液的MCP含量差异不显著（P0.05），B2组发酵液的MCP含量最高，为0.79 g/L，A3组最低，为0.65 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.002.T004表4体外发酵48 h NH3-N和MCP含量项目NH3-N/(mg/L)MCP/(g/L)A1组139.4b0.78A2组151.1ab0.80A3组171.0a0.65B1组171.8a0.78B2组143.8ab0.79B3组151.3ab0.68SEM0.4070.022P值0.0010.1862.4体外发酵48 h发酵液VFA含量（见表5）由表5可知，体外发酵48 h后，A2组乙酸含量极显著高于A1、B3组（P0.01）；B3组丁酸含量极显著低于A2组（P0.01）。A3组异丁酸含量最高，为0.82 mmol/L；B3组最低，为0.54 mmol/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.14.002.T005表5体外发酵48 h发酵液VFA含量项目乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)异丁酸/(mmol/L)丁酸/(mmol/L)异戊酸/(mmol/L)戊酸/(mmol/L)总VFA/(mmol/L)乙酸/丙酸A1组27.29Bbc13.60ab0.72ABCab8.63ABab1.33Aab0.76b52.34ABbc2.01ABabA2组32.90Aa15.60ab0.74ABab9.86Aa1.46Aa0.98a61.56Aa2.11AaA3组28.32ABbc13.25b0.82Aa8.34ABab1.35Aab0.71b52.80ABbc2.14AaB1组30.65ABab15.79a0.69ABCab8.95ABa1.10ABbc0.92ab58.09ABab1.94ABbcB2组29.48ABab14.07ab0.61BCbc8.30ABab1.05ABbc0.74b54.26ABabc2.10AabB3组25.15Bc13.64ab0.54Cbc6.85Bc0.89Bc0.73b47.81Bc1.84BcSEM0.5970.3140.0210.2560.0470.0291.1310.024P值0.0090.0240.0030.010.0030.0320.0140.004A2组总VFA含量最高，为61.56 mmol/L，B3组最小，为47.81 mmol/L，且极显著低A2组（P0.01）。3讨论3.1高精料日粮对牦牛体外发酵48 h的GP及产气速率的影响产气量是衡量瘤胃微生物消化代谢的重要指标，能够反映微生物对底物发酵利用的程度[15]。雷冬至等[16]研究表明，饲料的发酵能力强，导致瘤胃微生物的活性高，产气量高，饲料中有机物含量低，瘤胃微生物活性弱，产气量低。本试验中，B3组的GP高，而A组的GP较低，原因可能是高精料日粮会引起牦牛瘤胃内微生物紊乱，导致对发酵底物的分解和利用减弱。另外，随着发酵时间的延长，瘤胃微生物对发酵底物的消化利用逐渐增加，使产气量增加[17]。因此，日粮精粗比对牦牛短期育肥具有关键作用。3.2高精料日粮对牦牛体外发酵48 h的IVDMD的影响干物质降解率可以反映发酵过程中日粮被瘤胃微生物消化程度[18]。在瘤胃发酵的过程中，瘤胃内的微生物对反刍动物起重要作用，不同的日粮精粗比会影响瘤胃微生物菌群结构。王加启等[19]发现，精料的比例达70%后，瘤胃酸度会降低导致瘤胃内菌群变化，使有机物和酸性洗涤纤维呈下降的趋势，说明精料的比例越高，瘤胃微生物菌群的变化越明显。张群英等[20]研究表明，IVDMD高说明瘤胃发酵好、瘤胃微生物活性强，有利于提高饲料内的营养物质利用。本试验结果表明，A组的IVDMD低于B组，可能因为饲喂高精料的牦牛瘤胃内的微生物菌群紊乱，对精料的消化利用降低。3.3高精料日粮对牦牛体外发酵48 h的NH3-N和MCP含量的影响NH3-N含量可以反映瘤胃的微生物对饲料中含氮物质的分解和利用[21]。NH3-N含量过高或过低，均会对瘤胃微生物产生不利影响[22]。孙美杰等[23]研究发现，在未处理秸秆组中，当尿素添加剂量达1 000 mg/L时，发酵液中氨的含量达440.5~476.9 mg/L，总菌和原虫的数量均显著降低，说明高浓度的氨会抑制瘤胃微生物的生长和繁殖，影响其对底物的发酵利用。研究表明，高精料日粮会降低反刍动物后肠道以及粪便中微生物的丰度和多样性[24-25]。本试验中，A3组的NH3-N含量较高，MCP最低说明高精料日粮抑制了牦牛瘤胃微生物的生长。3.4高精料日粮对牦牛体外发酵48 h的VFA含量的影响VFA是反刍动物瘤胃日粮中碳水化合物和蛋白质的最终产物，为机体提供70%~80%的能量[26]。不同精粗比的日粮对瘤胃VFA的影响较大，且可以改变瘤胃发酵方式，导致乙酸、丙酸、丁酸和总VFA的产量不同[27]。Pourazad等[28]研究发现，与采食36%低精料日粮的奶牛相比，采食64%高精料日粮会提高奶牛瘤胃中总SCFA含量，且丙酸、丁酸、戊酸和异戊酸的含量分别提高28%、39%、32%和53%，乙酸含量降低20%。本试验中，A3组的乙酸、丁酸、丙酸、戊酸含量较低，在总VFA含量上，A2组最高，为61.56 mmol/L，B3组最低，为47.81 mmol/L。因此，在饲喂高精料日粮的情况下，并未为机体提供更多的能量，反而会降低牦牛瘤胃中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的含量，进而导致牦牛的生长性能下降。4结论饲喂比例过高的精料会使牦牛瘤胃微生物发生紊乱，降低干物质降解率，影响MCP合成，减少VFA含量，抑制牦牛的瘤胃发酵。