蛋白酶是一种能够水解蛋白质的生物催化剂，可以将蛋白质水解为蛋白胨、多肽、游离氨基酸[1]；同时具有催化活性高、条件温和、环保无污染、专一性强等优点[2-4]，被广泛应用于畜牧、医药、食品、制革、污水处理等领域[5]。蛋白酶主要存在于植物茎叶及果实、动物内脏和微生物中[6]。饲用蛋白酶可以改善动物（尤其是幼龄）的生产性能、促进内源酶分泌及消化器官的发育[7-8]、降解饲料中抗营养因子[9]、提高营养的消化率[10]、提高机体免疫力[11]等，可作为绿色、安全、无污染的添加剂。蛋白酶可按最适反应pH值的不同，分为碱性、中性和酸性蛋白酶[12]。全球工业酶销售额约为37.4亿，其中蛋白酶占60%，碱性蛋白酶占25%[13-17]。蛋白酶在原料资源紧张、成本上涨的畜牧饲料行业中发挥着巨大的作用[18]。为了解不同碱性蛋白酶产品的差异性，本研究对多种碱性蛋白酶的酶学性质进行比较，为碱性蛋白酶在畜牧业中的合理应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料碱性蛋白酶由不同厂家提供的5种碱性蛋白酶，分别命名为A、B、C、D、E。1.2试验试剂福林试剂、无水碳酸钠、氢氧化钠、浓盐酸、四硼酸钠、干酪素、L-酪氨酸、三氯乙酸等。其中L-酪氨酸是生物试剂，其余均为分析纯。1.3试验仪器CP2102电子天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）、FiveEasy Plus pH计（梅特勒-托力多仪器（上海）有限公司）、HJ-6A数显恒温磁力加热搅拌器（常州金坛良友仪器有限公司）、TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）、HH-4数显恒温水浴锅（常州智博瑞仪器制造有限公司）、752紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）。1.4试验方法1.4.1蛋白酶活性测定参考GB/T 23527—2009进行蛋白酶活性检测（福林法）。1.4.2蛋白酶酶学性质分析1.4.2.1最适反应温度将蛋白酶反应体系的温度分别调整为20、30、40、50、60、70 ℃，进行酶促反应，最后计算相对酶活性（最高酶活设为100%）。1.4.2.2热稳定性将蛋白酶分别放在40、60、80、100 ℃的水浴锅中孵育，每隔一段时间取样进行酶促反应，计算相对酶活（最高酶活设为100%）。1.4.2.3最适反应pH值将酶反应体系的pH值分别调整为7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5，进行酶促反应，计算相对酶活（最高酶活设为100%）。1.4.2.4pH值稳定性将蛋白酶分别放在不同的pH值（7.5~12.5）环境中，25 ℃孵育1 h，取样进行酶促反应，计算相对酶活（最高酶活设为100%）。1.4.2.5金属离子对酶活的影响在蛋白酶稀释液中分别加入10 mmol/L的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+和Co2+溶液，25 ℃孵育1 h，进行酶促反应，计算相对酶活（未加金属离子酶活设为100%）[19]。1.4.2.6化学试剂对酶活的影响在蛋白酶稀释液中分别加入5 mmol/L SDS、10 mmol/L SDS、2 mol/L EDTA和4 mol/L尿素，25 ℃孵育1 h，进行酶促反应，计算相对酶活（未加化学试剂酶活设为100%）[20]。1.4.2.7碱性蛋白酶对胃-胰蛋白酶的耐受性取1 mL稀释酶液，加50 mL pH值2.50的HCl缓冲液，取出2.25 mL混合液，加入2.25 mL的5 g/L胃蛋白酶，37 ℃温育1.5 h。取出2.25 mL混合液，调节pH值至6.50，再加入2.25 mL的5 g/L胰蛋白酶，37 ℃温育4 h，取适量处理液，稀释，在标准检测条件下检测酶活，计算相对酶活（未处理组酶活设为100%）[21]。1.4.2.8酶促反应动力学研究酶促反应的速率以及底物浓度对速率的影响。配置不同浓度的底物溶液（1.25~15.00 g/L），进行酶促反应，计算酶活力。使用双倒数作图法，横坐标为1/底物浓度，纵坐标为1/ν。由此信息做出的二元一次方程，与横轴截距是负的米氏常数的倒数，与纵轴截距是酶促反应最大速度的倒数[22]。Km值是酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数。Km大小只与酶自身的性质有关，不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同[23]。Km值越小，达到最大反应速率一半所需要的底物浓度就越小，酶与底物的亲和力越好，这个底物被叫为最适底物。1.5数据统计与分析试验数据使用Microsoft Excel进行记录和统计，使用Origin 75软件进行作图。2结果与分析2.1碱性蛋白酶最适反应温度（见图1）由图1可知，酶A、B、C和E的最适反应温度均是60 ℃，酶D的最适反应温度是50 ℃。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.09.003.F001图1碱性蛋白酶的最适反应温度Fig.1Optimal reaction temperature of alkaline protease2.2碱性蛋白酶的热稳定性（见图2）将5种碱性蛋白酶在40 ℃孵育5 h，每隔1 h取样测定酶活力。由图2（a）可知，0~1 h酶活损失较小，1~3 h酶D和酶E酶活损失较小，3~5 h只剩酶D还剩有较高酶活，其他酶活下降明显。因此，酶D的热稳定最好，总体热稳定性为DEBCA。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.09.003.F002图2碱性蛋白酶的热稳定性Fig.2Thermal stability of alkaline protease将5种碱性蛋白酶在60 ℃孵育5 h，每隔30 min 取样测定酶活力。由图2（b）可知，0~1 h酶活迅速降低，1~5 h 降低速度趋于平缓，最后完全失活。将5种碱性蛋白酶在80 ℃孵育60 s，每隔15 s取样测定酶活力。由图2（c）可知，0~30 s损失一半酶活，30~45 s迅速损失剩余酶活，45~60 s损失速度降慢，最后完全失活。将5种碱性蛋白酶在100 ℃孵育40 s，每隔10 s取样测定酶活力。由图2（d）可知，0~10 s损失三分之一酶活，10~30 s迅速损失剩余酶活，30~40 s损失速度降慢，最后完全失活。2.3碱性蛋白酶的最适反应pH值（见图3）由图3可知，酶的最适反应pH值均为10.5，符合碱性蛋白酶的特点。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.09.003.F003图3碱性蛋白酶的最适反应pH值Fig.3Optimal reaction pH of alkaline protease2.4碱性蛋白酶的pH值稳定性（见图4）由图4可知，酶A、C、D和E在pH值7.5~12.5时酶活稳定，相对酶活在79%以上；酶B在pH值7.5~10.5时酶活稳定，在pH值10.5~12.5时酶活下降到40%以下。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.09.003.F004图4碱性蛋白酶的pH值稳定性Fig.4pH stability of alkaline protease2.5金属离子对碱性蛋白酶活性的影响（见图5）由图5可知，金属离子主要对酶A、C和E起抑制作用，对酶B和D起激活作用，其中Cu2+对酶的抑制作用显著，使酶活低于25%，其他金属离子对酶活影响不显著，使酶活在80%~120%之间变化。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.09.003.F005图5金属离子对碱性蛋白酶活性的影响Fig.5Effect of metal ions on activity of alkaline protease2.6化学试剂对碱性蛋白酶活性的影响（见图6）由图6可知，EDTA对酶A有抑制作用，尿素对酶E有抑制作用，其他化学试剂对酶活的影响不大或者无影响。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.09.003.F006图6化学试剂对碱性蛋白酶的影响Fig.6Effect of chemical reagents on alkaline protease2.7胃-胰蛋白酶对碱性蛋白酶活性的影响（见图7）由图7可知，5种酶对胃-胰蛋白酶的耐受性均不好，经处理后5种酶的相对酶活均降低到20%以下。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.09.003.F007图7胃-胰蛋白酶对碱性蛋白酶活性的影响Fig.7Effect of gastric-trypsin on activity of alkaline protease2.8酶促反应动力学（见图8）由图8可知，利用双倒数作图法得到酶A的最大反应速率νmax=0.79 g/min，Km=9.09；酶B的最大反应速率νmax=1.75 g/min，Km=33.33；酶C的最大反应速率νmax=0.07 g/min，Km=3.45；酶D的最大反应速率νmax=0.05 g/min，Km=4.35；酶E的最大反应速率νmax=0.09 g/min，Km=8.33。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.09.003.F008图8酶促反应动力学曲线Fig.8Enzymatic reaction kinetics curve3讨论酶制剂在饲料中的使用以及作用效果受酶制剂的种类、添加方式、添加量等多种因素影响[24]。目前对酶制剂的研究有限，并不能完全掌握酶制剂的作用机制。不同的学者研究得出不同的结果，所以酶制剂在饲料应用中还存在限制。本试验结果表明，酶A、B、C和E的最适反应温度均是60 ℃，酶D的最适反应温度是50 ℃。因为酶的本质是蛋白质，适宜的温度有利于酶促反应，超出酶耐受范围的温度会导致蛋白质发生不可逆变性[22]。5种碱性蛋白酶在40 ℃时热稳定性最好，温度升高后，几秒后酶活迅速降为零，因此这5种碱性蛋白酶均不适合制粒加工，因为饲料制粒温度高达80 ℃。单纯考虑温度，5种酶适合在畜禽的肠道中使用，最适合的是酶D，因为肠道温度约40 ℃[20]。5种碱性蛋白酶的最适pH均为10.50，并在碱性条件下稳定，符合碱性蛋白酶在中性或碱性环境中高活力的特征，但不能在pH值2.2~3.5的禽胃和pH值5.0~7.0的小肠中长时间停留[21]。酶制剂在储存和应用过程中，会添加或接触一些金属离子，这些金属离子会对蛋白酶的酶活力产生一定的影响。本研究中，K+对其中4种酶均有轻微抑制作用，而柴金龙等[25]研究表明，K+对重组蛋白酶OSP有强力促进作用。Na+对酶活几乎无影响，与蔡恒博[22]的研究结果相似。Cu2+对5种酶均有强烈抑制作用，而陈琳[26]研究表明，Cu2+对低温蛋白酶有明显激活作用。本研究中，Mn2+对其中3种酶有抑制作用；Ca2+对其中3种酶有促进作用；Zn2+对其中4种酶有抑制作用；Mg2+对其中2种酶有促进作用；Co2+对其中3种酶有抑制作用。陈琳[26]研究表明，Mn2+激活低温蛋白酶酶活，Fe3+抑制酶活，Ca2+、Zn2+、Mg2+、Co2+对酶活力影响较小或无明显影响。Gupta等[27]研究表明，Ca2+对耐有机溶剂蛋白酶有抑制作用。Uttatree等[28]和柴金龙等[25]研究表明，Mg2+对耐有机溶剂蛋白酶和重组蛋白酶OSP有促进作用。本试验中，化学试剂对酶活有不同的影响，对胃-胰蛋白酶耐受性差，再次证明5种碱性蛋白酶不适合长时间存在于动物体内。饲用酶制剂作为高效、绿色的外源添加剂，能提高动物的生产性能，给养殖者带来经济效益。要大力发展饲用酶制剂的新结构，向规范化、精细化、安全化看齐，做到促消费、稳就业、服三农[29]。4结论本试验涉及的5种碱性蛋白酶，最适反应温度有4种相同，热稳定性不同，最适反应pH值相同，对pH值的耐受性不同，受金属离子和化学试剂的影响不同，对胰-胃蛋白酶的耐受性均较差，酶促反应动力学不相同。综上所述，不同的碱性蛋白酶有着不同的酶学特性，应用时要选择适合的，发挥最大酶效应。