黄曲霉毒素（AFs）是由黄曲霉、寄生曲霉以及特异曲霉等多种菌株产生的次级代谢产物。天然的AFs包括AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，在牛奶中发现并分离出其衍生物AFM1、AFM2。AFs中AFB1的毒性最强[1]。AFB1对动物具有致畸、致癌和免疫抑制作用[2]，会造成肝、肾、脾、口腔、消化道、大脑和神经系统等一系列损伤[3]。各种动物中雏鸭对AFs最敏感，猪、火鸡、仔鸡对AFs敏感，反刍动物不敏感[1]。研究表明，家禽饲料中AFB1阳性检出率较高，约有14.29%的禽饲料中AFB1水平和霉菌群含量超过规定限值[4]。家禽在采食AFB1污染的饲料后，采食量、产蛋量、胫骨强度及免疫性能均下降[5-6]。猪AFB1中毒表现为采食量减少，生长性能下降，肝功能、免疫功能及抗氧化功能受损，严重时会导致死亡[7-10]。母猪中毒严重时会产死胎、畸形胎。反刍动物对AFs有一定的耐受能力，但也会出现中毒现象，主要表现为饲料转化率降低，生长性能、免疫能力和繁殖能力受影响，而且乳汁中会含有AFM1。虽然AFM1毒性弱于AFB1，但AFM1也可导致DNA损伤、基因突变、染色体畸变[7]。饲料中添加霉菌毒素脱霉剂是去除配合饲料中霉菌毒素最常用的方法之一[11-13]。蒙脱石是2层硅氧四面体片夹1层铝氧八面体片构成的2∶1型结构的硅酸盐黏土矿[14]。蒙脱石可以利用较大的比表面积、化学和机械稳定性、层状结构、较高的阳离子交换容量吸附固定霉菌毒素、重金属、病原菌及细菌毒素[15-17]。在AFs、玉米赤霉烯酮（ZEA）、呕吐毒素（DON）等霉菌毒素中，对AFs的吸附效果最好[18]。梁晓维等[19]将蒙脱石添加到含有AFB1、ZEA和T-2毒素的人工胃液或人工肠液中，发现1 h后吸附达到平衡，钠基蒙脱石对AFB1和T-2毒素的吸附率分别为96.8%、38.0%，对ZEA的吸附效果较差，吸附率低于10%。有研究表明，在奶牛饲料中添加钙蒙脱土能够有效降低牛奶中AFs的浓度，且不影响牛奶的质量、成分和产量[20]。蒙脱石对AFB1的吸附率受蒙脱石有效含量、蒙脱石添加量、饲料中AFB1的浓度、吸附条件（温度、pH值、吸附时间等）的影响。目前，不同条件下蒙脱石对AFB1吸附效果的研究仍不够全面和系统化。因此，本试验选取5种不同有效含量的蒙脱石作为研究对象，通过体外吸附试验研究不同条件下蒙脱石对AFB1的吸附效果，为其在饲料脱毒方面的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料5种不同含量的蒙脱石产品（有效含量分别为70%、85%、92%、95%、98%）购自内蒙古和正美生物科技有限公司。乳猪料购自赤峰大北农农牧科技有限公司。1.2试验试剂甲醇（分析纯）、AFB1标准品、盐酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、AFB1酶联免疫检测试剂盒（德国拜发）。1.3仪器设备METTLER TOLEDO AB204E型电子分析天平（梅特勒-托利多，上海有限公司）；WD-9405B水平摇床（北京六一生物科技有限公司）；5810R大容量高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；BIO-RAD全波长酶标仪（美国伯乐公司）；GHP-9270隔水式恒温培养箱（上海一恒科技）；FW-100多功能粉碎机（天津市泰斯特仪器公司）。1.4AFB1污染饲料的制备将AFB1标准品溶于甲醇，均匀喷洒在少量乳猪料上，混匀后制成AFB1含量分别为50、100 μg/kg的试验样本。经检测，AFB1含量为48.9、98.8 μg/kg。1.5饲料中AFB1的含量测定称取5.00 g样品，置于50 mL带盖的离心管中，按试剂盒说明书要求的比例往离心管中加入试剂盒提供的提取剂（70%甲醇溶液25 mL），恒温振荡3 min，取上清液经去离子水稀释后使用德国拜发公司AFB1 ELISA试剂盒测定上清液中AFB1的含量。1.6AFB1浓度、蒙脱石添加量、蒙脱石含量对蒙脱石体外吸附AFB1的影响分别称取5.00 g毒素含量为48.9、98.8 μg/kg饲料样品各45份，置于50 mL带盖离心管中，将5种不同含量的蒙脱石分别以饲料量的0.2%、0.3%、0.4%加入离心管中，按试剂盒说明书要求加入25 mL 70%甲醇提取溶液，恒温振荡提取1 h，4 000 r/min离心4 min，吸取上清液，调pH值为3，使用ELISA法测定上清液中AFB1含量。试验共90个样品，分为30个处理，每个处理3个重复，试验数据取平均值。按照公式计算吸附率Y。Y=(C0-C)/C0×100%(1)式中：C0为AFB1初始浓度（mg/L）；C为平衡时上清液中AFB1的浓度（mg/L）。1.7pH值对蒙脱石体外吸附AFB1的影响在研究AFB1浓度、蒙脱石添加量、蒙脱石含量对蒙脱石体外吸附AFB1的影响，并得出吸附效果最佳且最合适的蒙脱石含量及添加量（蒙脱石最佳添加组合）后，使用氢氧化钠和盐酸溶液调pH值，并分别在pH值为2、3、4、5、6、7条件下测定最佳添加组合下蒙脱石对AFB1的吸附率。1.8吸附时间对蒙脱石体外吸附AFB1的影响带毒饲料按最佳添加组合添加蒙脱石后，按试剂盒说明书要求加入提取溶液，分别于37 ℃恒温振荡提取5、15、25、35、55、75、95、115 min，高速离心，取上清液，使用ELISA法测定上清液中AFB1含量，计算吸附率。1.9温度对蒙脱石体外吸附AFB1的影响带毒饲料按最佳添加组合添加蒙脱石后，按试剂盒说明书要求加入提取溶液，分别于20、25、30、35、40 ℃恒温振荡提取1 h，高速离心，取上清液，使用ELISA法测定上清液中AFB1含量，并计算吸附率。1.6、1.7、1.8和1.9中均设置不添加吸附剂处理组，以消除试验过程中AFB1的非特异性吸附。2结果与分析2.1饲料中AFB1浓度、蒙脱石有效含量及添加量对蒙脱石吸附AFB1的影响（见表1）由表1可知，蒙脱石对高浓度毒素饲料中AFB1的吸附效果优于对低浓度毒素饲料中AFB1的吸附效果。蒙脱石有效含量70%~92%范围内，AFB1吸附率随蒙脱石有效含量的升高而不断升高；但只有蒙脱石有效含量高于90%时才能达到80%以上的良好吸附效果；蒙脱石有效含量高于95%后，继续提高蒙脱石有效含量对AFB1吸附率无明显增强。不同蒙脱石添加量的吸附效果为0.4%添加量0.3%添加量0.2%添加量，即随着蒙脱石添加量的增加，蒙脱石对AFB1的吸附率也随之增加。因此，选择蒙脱石的有效含量92%、添加量0.4%为蒙脱石添加组合，采用高浓度毒素饲料进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.020.T001表1饲料中AFB1浓度、蒙脱石有效含量及添加量对蒙脱石吸附AFB1的影响项目48.9 μg/kg AFB198.8 μg/kg AFB10.2%添加量0.3%添加量0.4%添加量0.2%添加量0.3%添加量0.4%添加量70%蒙脱石58.470.170.860.168.272.185%蒙脱石66.272.376.767.177.376.892%蒙脱石80.190.592.584.393.193.295%蒙脱石79.190.293.886.293.394.398%蒙脱石80.392.395.289.195.095.5%2.2pH值对蒙脱石吸附AFB1的影响（见表2）由表2可知，蒙脱石在酸性条件下对AFB1的吸附效果较好。pH值为2时吸附率最高，为93.2%；pH值从2上升到7，AFB1吸附率仅降低2.1%，且均在90%以上。结果表明，酸性条件下蒙脱石脱毒效果较好，pH值对蒙脱石脱毒效果影响不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.020.T002表2pH值对蒙脱石吸附AFB1的影响项目pH值23456792%蒙脱石93.293.192.492.191.191.0%2.3吸附时间对蒙脱石吸附AFB1的影响（见表3）由表3可知，蒙脱石对AFB1的吸附在55 min时接近平衡，此时蒙脱石对AFB1的吸附率达93.2%。在此之前，随着吸附时间的增加，蒙脱石对AFB1的吸附率显著增加；从开始吸附5~55 min，吸附率的增幅高达71%；在55 min之后，吸附曲线趋近平稳；在95 min时，吸附率达到最高，为94.8%；在第115 min时，吸附率相比95 min时略低。结果表明，该蒙脱石的最佳吸附时间为95 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.020.T003表3吸附时间对蒙脱石吸附AFB1的影响项目吸附时间/min515253555759511592%蒙脱石22.236.969.788.893.294.194.894.5%2.4吸附温度对蒙脱石吸附AFB1的影响（见表4）由表4可知，在20~40 ℃范围内，蒙脱石对AFB1的吸附率受温度影响较大。在35 ℃时，吸附率达到最高，为93.2%；20~35 ℃，吸附率明显增加，增幅达到47.3%；40 ℃时，吸附率为93.1%，与35 ℃时差异不大。结果表明，该蒙脱石的最佳吸附温度为35~40 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.020.T004表4吸附温度对蒙脱石吸附AFB1的影响项目温度/℃202530354092%蒙脱石45.960.886.193.293.1%3讨论3.1饲料中AFB1浓度、蒙脱石有效含量及添加量对蒙脱石吸附AFB1的影响本试验结果表明，饲料中AFB1浓度越大，蒙脱石对AFB1的吸附效果越好，与徐瑞等[3]的研究结果略有差异。徐瑞等[3]研究发现，随着饲料中AFB1浓度的升高，蒙脱石对AFB1的吸附率逐渐降低，且吸附率降低的幅度随着饲料中毒素浓度的升高加大。原因可能是蒙脱石相对霉菌毒素的量不同，蒙脱石的吸附能力存在饱和性，且饱和吸附量小[21]。本试验中蒙脱石总吸附能力相对AFB1的量偏大，在吸附结束后未达饱和状态，而徐瑞等[3]的试验中蒙脱石总吸附能力相对AFB1的量偏小，在未吸附完全时已经达到饱和状态，所以吸附率随毒素浓度的增加而减小。如果在提高AFB1浓度的同时，同步提高蒙脱石的添加量，则可以达到更好的吸附效果。产品中蒙脱石的有效含量以及在饲料中添加量的增加均会提高蒙脱石对AFB1吸附率。本试验中，蒙脱石有效含量高于90%时，毒素吸附效果受蒙脱石有效含量影响不明显，而两种毒素浓度下均是0.4%添加量的效果最好，所以认定“92%含量蒙脱石，0.4%添加量”为吸附饲料中AFB1的良好组合。而在实际生产中，不可能单一从饲料中AFB1的浓度来确定蒙脱石的添加量，还需要考虑饲喂添加蒙脱石的饲料对畜禽生产性能的影响以及经济性等因素。过量添加蒙脱石对畜禽的健康和生产性能存在负面影响。有研究表明，蒙脱石会从饲料中吸附矿物质和营养物质，导致饲喂该饲料的动物缺乏铁、钾和维生素等微量营养素[22]。齐志国等[14]研究表明，北京油鸡蛋鸡日粮中添加0.3%、0.4%蒙脱石会显著降低蛋鸡的血清总抗氧化能力及生产性能，而添加0.2%蒙脱石组产蛋率、平均日产蛋重以及总超氧化物歧化酶含量均显著提高；在霉菌毒素不超标的情况下，0.2%添加量为北京油鸡饲粮推荐添加剂量。因此，不能单一从饲料中AFB1的含量来确定蒙脱石的添加量，需要从饲用对象的耐受能力、饲料中霉菌毒素浓度、添加剂中蒙脱石的有效含量以及经济性等多方面考虑蒙脱石适宜的添加量。3.2pH值、吸附时间及吸附温度对蒙脱石吸附AFB1的影响动物采食后，食物在胃内进行消化，随后进入小肠中进行进一步消化吸收。胃内分泌胃酸，消化体系呈酸性，pH值约为2~3；小肠消化体系呈弱碱性，pH值约为7~8。本试验调pH值为2~7，探究pH值对蒙脱石吸附AFB1的影响。试验发现，pH值对吸附率影响并不明显，在pH值为2~7范围内，蒙脱石对AFB1的吸附率均达到90%以上，吸附效果较好。AFB1的等电点为4.17，蒙脱石表面有大量负电荷[21]，单一地从静电吸附的角度而言，在pH值2~4.17条件下，AFB1带正电荷，有利于蒙脱石的吸附；在pH值4.17~7条件下，AFB1带负电荷，不利于蒙脱石的吸附。但由于AFB1含量较低，且蒙脱石对AFB1的吸附以化学吸附为主，所以pH值对蒙脱石吸附AFB1的影响并不明显，与前人的研究结果一致[23]。本试验中蒙脱石对AFB1的吸附在55 min接近吸附平衡，与梁晓维等[19]试验得出的吸附平衡时间相近，但也有试验发现吸附在20 min达到平衡[23]。吸附达到平衡的时间不一致可能是由于试验环境、蒙脱石种类、是否改性等因素不同。各试验吸附曲线与本试验基本一致。在试验吸附初始阶段，蒙脱石的吸附率迅速升高，直至平衡；在平衡后，延长吸附时间对吸附的影响不再明显。这是因为在吸附初始阶段，蒙脱石表面的吸附位点充足，AFB1的浓度相对较高，AFB1可迅速被蒙脱石固定并与之结合形成复合体；随着吸附时间的延长，AFB1的含量和蒙脱石空余位点均减少，吸附速率减慢，直至吸附平衡。常见的饲养动物体温一般在37~40 ℃之间，本试验结合气温选择20~40 ℃为温度区间，测试蒙脱石对AFB1的吸附效果。试验发现，蒙脱石在35~40 ℃之间对AFB1吸附效果较好，表明蒙脱石在动物体内能够发挥良好的脱毒效果。4结论蒙脱石对AFB1吸附率与蒙脱石有效含量呈正相关。有效含量大于90%时，对AFB1有良好的吸附效果；蒙脱石含量高于95%后，蒙脱石对AFB1的吸附效果较稳定；饲料中AFB1水平及蒙脱石添加量越高，蒙脱石对AFB1吸附率越高。但是，蒙脱石添加量不能超过动物的耐受能力。pH值对蒙脱石吸附AFB1效果影响不明显，但酸性条件下有利于蒙脱石吸附AFB1；吸附约1 h达到吸附平衡，在1 h内吸附效果与吸附时间呈正相关；1 h后，蒙脱石对AFB1吸附效果较为稳定；95 min时达到最佳吸附。20~40 ℃范围内，蒙脱石对AFB1的吸附率与吸附温度呈正相关。