硒(Se)是动物生命必需微量元素之一,具有提高机体抗氧化能力、促进动物生长等功能,与动物的生长、繁殖和疾病预防密切相关[1-2]。本研究前期工作中,通过多次筛选、纯化、分离得到1株高产胞外多糖的细菌菌株Z0206。初步研究表明,该菌株能够耐受高浓度的Na2SeO3,并且能够将无机硒转化为有机硒和单质硒。将由菌株Z0206发酵制备得到的主要产物命名为Z0206富硒多糖[3]。在小鼠和家禽上应用,发现Z0206富硒多糖具有较强的抗氧化和免疫功能[4-5]。但是,硒的安全阈值较窄,硒缺乏和过量均会对机体造成不利影响[6]。研究表明,缺硒会导致动物产生炎症反应和氧化应激,甚至引起白肌病和肝坏死,严重影响动物的健康和生产效率[7-8]。王立平等[9]发现,补硒过量会导致动物生长停滞、免疫功能受损,严重时会导致机体中毒,甚至死亡。农业农村部1224号公告《饲料添加剂安全使用规范》规定,硒在饲料中的最高限量为0.5 μg/g,推荐添加量为0.1~0.3 μg/g。有关硒的检测方法和判定标准也大多以硒的总量为标准[10]。因此,饲料中硒的总量测定至关重要。目前,测定总硒时,样品前处理方法大多采取HNO3-HClO4混合酸体系进行湿法消解,再利用HCl对其进行还原[11-12],使得硒化合物统一转化为Se4+。在酸性条件下Se4+与2,3-二氨基萘反应生成4,5-苯并苤硒脑,然后通过荧光分光光度计定量分析衍生物[13-17]。上述前处理过程冗长、试剂耗量大,尤其是在高浓度酸介质存在时操作需十分谨慎。HPLC-ICP-MS技术具有元素分析、识别金属的不同同位素、灵敏度高、准确度高等优点[18-24]。本研究对传统的消解及检测方法加以改进,以H2O2-HCl体系代替HNO3-HClO4加热回流消解的方法,利用H2O2在HCl提供的酸性条件下的氧化性和HCl的还原性将样品中的硒一步氧化还原成为SeO32-离子,采用HPLC-ICP-MS测定78Se,从而计算出样品中的硒含量。本研究旨在建立1种快速消解硒蛋白多糖样品,并利用HPLC-ICP-MS测定其总硒的方法,为畜牧业中富硒产品硒含量的测定提供快速、简便的分析方法。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试剂及配制方法亚硒酸钠标准品(纯度99%)、七氟丁酸(纯度99%)、2,3-二氨基萘(纯度95%),均购自Sigma公司。磷酸二氢钾、EDTA二钠、盐酸羟胺、盐酸、30%过氧化氢、环己烷均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。DAN试剂(1.0 g/L)的配制:参照GB 13883—2008《饲料中硒的测定》。1.1.2仪器数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、pH计(美国Mettler Toledo公司)、Softmax pro-5多功能连续光谱酶标仪(美国Molecular Devices公司)、纯水仪(日本Yamato公司)、iCAP RQ电感耦合等离子体质谱仪(美国Thermo Scientific公司)、Ultimate-3000高效液相质谱仪(美国Thermo Scientific公司)。1.2样品的制备富硒多糖的制备参考课题组前期研究报道,略有改进[25],使用两批不同发酵批次的样品作为本试验的材料进行对比。文章中饲料1和饲料2分别为第一批和第二批发酵产物。富硒酵母购自安琪酵母股份有限公司。1%蛋鸡产蛋期预混合饲料购自帝斯曼(中国)有限公司。1.3富硒多糖样品的前处理及分析H2O2-HCl氧化还原一步法:分别准确称取25 mg富硒多糖样品、富硒酵母及预混合饲料于50 mL离心管中,各加入2 mL H2O2和1.5 mL HCl,2 mL H2O2和2 mL HCl,3 mL H2O2和2 mL HCl等不同的试剂比例,对样品进行消解,同时分别设置空白对照管,充分涡旋混匀。50 ℃水浴30 min,沸水浴30 min。冷却后,将上述反应液全部转移到容量瓶中,并用去离子水定容至100 mL。取出少量样品用0.22 µm水相滤膜过滤,所得滤液稀释3倍。利用HPLC-ICP-MS在KED模式下分析测定78Se的离子强度,与亚硒酸钠标准品进行对比,从而得到不同饲料样品中总硒含量。HNO3-HClO4混合酸消解法:准确称取0.3~0.5 g富硒多糖样品,加入10 mL HNO3-HClO4混合酸(9+1)冷消化过夜。12 h后于电热板上加热消解至剩余体积约2 mL,冷却后再加5 mL盐酸溶液(6 mol/L),继续加热至剩余体积约2 mL。同时做试剂空白。冷却后使用去离子水定容至100 mL,量取部分溶液(pH值1.5~2.0)加入3 mL盐酸羟胺和2 mL DAN,摇匀,沸水浴5 min。冷却后,使用10 mL环己烷萃取,用荧光光度计在激发波长为376 nm、发射波长为520 nm条件下测定荧光强度,从而计算出试样中的硒含量[26]。1.4标准曲线的制备准确称取50 mg亚硒酸钠溶解在500 mL 0.1 mol/L HCl中,使用去离子水逐步稀释成400.0、250.0、100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.5 µg/L的亚硒酸钠标准工作液。利用HPLC-ICP-MS在KED模式下分析测定78Se的离子强度。1.5HPLC-ICP-MS分析条件Hypersil GOLD C18质谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,美国Thermo Scientific公司);进样量25 μL;流动相:20 mmol/L磷酸二氢钾水溶液(pH值3.7,含0.1%七氟丁酸)95%+甲醇5%;流速1.2 mL/min[27]。射频功率:1 550 W;Q Cell 气体(He)流速:4.5 mL/min;冷却气(Ar)流速:14 L/min;KED电压:4 V;辅助气(Ar)流速:0.8 L/min;驻留时间:100 ms;雾化气(Ar)流速:1.1 L/min;分析质量数:78Se。1.6HPLC-ICP-MS方法验证以亚硒酸钠标准溶液的不同浓度为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y)制作标准曲线。通过相关系数(R2)判断标准曲线的线性。根据国际协调会议(ICH)指南(Q2B分析程序方法学的验证)中的信噪比法对检出限(LOD)(即3倍信噪比)和定量限(LOQ)(即10倍信噪比)分别进行测定,以评估方法的灵敏度。此外,通过计算保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD),以评估该方法的可重复性。2结果与分析2.1样品前处理H2O2在硒含量测定中的氧化作用已经在前期研究中得以证实[28-30]。原理如下:2HCl+3H2O2+Se⇌3H2O+Cl2↑+H2SeO3将2批富硒多糖样品、富硒酵母及预混合饲料在H2O2-HCl体系中进行氧化还原反应,使样品中的所有价态的硒元素被统一氧化还原成4价,因此对4价硒检测得到的是样品中总硒的含量。富硒多糖消解前后对比结果见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.022.F001图1富硒多糖消解前后对比由图1(a)可知,样品加入H2O2-HCl后,样品呈现浑浊状态。由图1(b)可知,50 ℃水浴加热30 min,沸水浴加热30 min后,所有样品呈现清澈、透明状。2.2线性范围与准确度不同浓度的亚硒酸钠标准工作液质谱分析见图2。HPLC-ICP-MS的方法验证见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.022.F002图2不同浓度的亚硒酸钠标准工作液质谱分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.022.T001表1HPLC-ICP-MS的方法验证(n=6)线性方程R2检出限/(μg/g)定量限/(μg/g)RSDR/%RSDP/%y=248.63x+387.210.999 70.170.572.592.64注:R2为相关系数;RSDR为保留时间的RSD;RSDP为峰面积的RSD。由图2可知,该方法测得不同浓度的亚硒酸钠峰形较好,保留时间稳定。由表1可知,以浓度为横坐标(x),78Se积分面积为纵坐标(y),拟合计算得到SeO32-的标准曲线方程及相关系数。线性方程:y=248.63x+387.21,相关系数R2=0.999 7。该方法线性很好,标准曲线线性范围为2.5~400.0 μg/L。经过验证,所建立HPLC-ICP-MS方法对硒的检出限为0.17 μg/g,定量限为0.57 μg/g,且峰面积与保留时间的RSD均小于3%。上述结果说明,该方法具有高灵敏度与重复性。2.3不同饲料样品中总硒含量不同饲料样品中总硒含量见表2。由表2可知,饲料1中总硒含量为1 118.00 μg/g,RSD为9.61%;饲料2中总硒含量为1 402.06 μg/g,RSD为7.00%;富硒酵母中总硒含量为941.13 μg/g,RSD为0.14%;预混合饲料中总硒含量为0.95 μg/g,RSD为10.19%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.022.T002表2不同饲料样品中总硒含量(n=6)项目总硒含量/(μg/g)RSD/%饲料11 118.00±98.109.61饲料21 402.06±98.187.00富硒酵母941.13±1.340.14预混合饲料0.95±0.1010.19此外,使用荧光分光光度计法测得饲料1中总硒的平均含量为1 249.70 μg/g。两种方法测定总硒含量十分接近。HPLC-ICP-MS方法对250 μg/L Na2SeO3和消解后富硒多糖的质谱分析见图3。由图3可知,得到Na2SeO3的保留时间为145.63 s。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.022.F003图3HPLC-ICP-MS方法对250 μg/L Na2SeO3和消解后富硒多糖的质谱分析HPLC-ICP-MS方法对250 µg/L Na2SeO3和消解后富硒酵母的质谱分析见图4。由图4可知,经过与标准品对比进行定量,得到富硒酵母中的总硒含量为941.13 μg/g,RSD为0.14%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.022.F004图4HPLC-ICP-MS方法对250 µg/L Na2SeO3和消解后富硒酵母的质谱分析HPLC-ICP-MS方法对10 μg/L Na2SeO3和消解后预混合饲料的质谱分析见图5。由图5可知。经过与标准品对比进行定量,得到预混合饲料中的总硒含量为0.95 μg/g,RSD为10.19%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.022.F005图5HPLC-ICP-MS方法对10 μg/L Na2SeO3和消解后预混合饲料的质谱分析12 mol/L HCl对富硒多糖进行消解的质谱分析见图6。由图6可知,12 mol/L盐酸消解样品进行HPLC-ICP-MS分析时,所得杂质峰对目标峰的影响较大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.022.F006图612 mol/L HCl对富硒多糖进行消解的质谱分析3讨论3.1不同的消解体系对结果的影响蒋剑波[31]在对大米中总硒进行测量时,采用氨水-盐酸体系对样品进行消解,消解液与DAN进行衍生后测定其在激发波长376 nm,发射波长520 nm处的荧光值。国标中则采取硝酸-高氯酸混合酸体系对样品进行消解。本试验同时采用HNO3-HClO4和H2O2-HCl两种不同的消解方法对样品进行消解,并采用荧光分光光度法和HPLC-ICP-MS法两种不同的检测方法对测定结果进行比较,两种方法测得总硒含量十分接近。此外,HNO3-HClO4混合酸体系消解样品需过夜且操作不安全,H2O2-HCl消解体系仅1 h即可完成样品的消解,且操作简单、安全性较高。因此,利用HPLC-ICP-MS法可以实现富硒饲料中总硒含量的快速、准确、安全检测。3.2不同的盐酸浓度对消解结果的影响本研究通过采用6 mol/L和12 mol/L两种不同浓度的盐酸对样品进行消解,以探究盐酸浓度对样品消解结果的影响。结果显示,与6 mol/L盐酸消解样品相比,12 mol/L盐酸消解样品不完全,HPLC-ICP-MS所得峰形中,基底效应较大,杂质峰对目标峰的影响较大。因此,本试验随后消解试验均采用6 mol/L HCl对样品进行消解。3.3不同的H2O2-HCl比例对消解结果的影响本研究分别采用了2 mL H2O2和1.5 mL HCl,2 mL H2O2和2 mL HCl,3 mL H2O2和2 mL HCl共3种不同比例的消解体系对样品进行消解(盐酸浓度均为6 mol/L),以探究最佳消解体系。结果表明,使用3种不同比例的消解体系处理所得样品中硒的含量基本一致,且使用2 mL H2O2和1.5 mL HCl体系消解时,样品消解过程更利于控制,试剂消耗更少。因此,本试验消解试验均采用2 mL H2O2和1.5 mL 6 mol/L HCl体系。3.4不同的反应温度对消解结果的影响由于H2O2-HCl体系消解样品的反应属于放热反应,本研究发现,直接采用沸水浴加热容易造成反应速度过快,使整个反应过程不易控制。因此,本研究中采用分阶段水浴加热法,先50 ℃消解样品0.5 h,再用沸水浴消解0.5 h。与传统HNO3-HClO4消解方法相比,采用分段加热法,使得反应稳定易于控制、反应迅速,极大地缩短了样品处理所需要的时间。3.5样品是否消解完全本研究中,样品在分段水浴中被H2O2-HCl消解成无色溶液状态。此外,本研究通过采用H2O2-HCl体系消解样品并用HPLC-ICP-MS检测的同时,采用HNO3-HClO4混酸消解样品并用荧光分光光度计检测进行对照。试验结果表明,两种方法检测所得富硒多糖样品中总硒含量基本一致,进一步验证了样品消解完全以及本方法的可靠性。3.6方法可靠性验证对LOD和LOQ的测定可以判断仪器方法的灵敏度。本研究中采用的方法对硒的检出限与定量限分别为0.17 μg/L和0.57 μg/L,说明该仪器方法灵敏度高。峰面积和保留时间的RSD均低于3%,说明该方法重复性好。此外,对不同种类的饲料样品中的总硒含量进行测定,除预混合饲料的测定RSD大于10%外(可能是因为预混合饲料中总硒含量较低,容易引起测定误差),其余饲料样品的测定RSD均小于10%,进一步说明该方法重复性好。4结论本研究建立1种基于H2O2-HCl体系一步氧化还原法消解不同的饲料样品,并用HPLC-ICP-MS检测总硒的方法。消解仅需要1.5 mL浓度为6 mol/L的HCl和2 mL H2O2,且在水浴加热下只需要反应60 min。结果与国标中HNO3-HClO4消解样品并用荧光分光光度计检测的结果高度一致。本方法快速、简便、环保、安全性好,适用于饲料样品总硒的快速检测。
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