共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是1种含有共轭双键的亚油酸同分异构体，具有构象和位置的异构[1]。CLA大量存在于肉制品、奶制品、海产品及植物性食品中。最丰盛的天然CLA来自乳脂肪。作为多不饱和脂肪酸，CLA能够抑制动物体内脂肪的沉积[2]。CLA可以通过诱导细胞凋亡的方式来降低脂肪的沉积[3]。研究发现，经CLA处理的前脂肪细胞发生明显的凋亡特征[4]。CLA可以使小鼠和猪体内的脂肪细胞发生明显的凋亡[5-6]。CAL能够通过抑制脂肪的积累，降低脂肪沉积，改善胴体的肉品质[7-8]。在国内外的研究中，以绵羊为模型研究CLA诱导脂肪细胞凋亡的机理还未见报道。本试验拟结合动物营养学技术与分子生物学技术，用含有CLA的日粮饲喂绵羊，研究CLA对脂肪细胞凋亡过程的影响，揭示其可能存在的作用机制，为生产脂肪含量低、功能性脂肪酸含量高、风味佳的健康羊肉提供参考。1材料与方法1.1试验材料共轭亚油酸钙盐购自青岛澳海生物有限公司，CLA产品成分见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.004.T001表1CLA产品成分成分标准要求检测结果棕榈酸95.3硬脂酸42.1油酸8~2011.1亚油酸31.3总亚油酸78~8480.2C9，t11CLA异构体≥3537.2t10，c12CLA异构体≥3537.6%1.2试验设计试验选择15只约2个半月龄、遗传背景一致、平均体重（16.49±1.20）kg、健康状况良好的小尾寒羊。按照完全随机分组试验设计将15只试验羊分为3组，分别为对照组、1.5% CAL组和3.5% CLA组，每组5只羊，每只羊为1个重复，实行单栏（2.0 m×1.2 m）饲养。对照组绵羊饲喂基础日粮，1.5% CLA组在基础饲喂日粮中添加1.5% CLA，3.5% CLA组在基础饲喂日粮中添加3.5% CLA。试验期间所用日粮为内蒙古兆禾生物科技有限公司提供的TMR颗粒料，基础日粮组成及营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.004.T002表2基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米34.00代谢能/(MJ/kg)9.33豆粕4.00干物质/%91.70棉籽饼4.00粗蛋白/%15.49麦麸2.50中性洗涤纤维/%34.82菜籽饼4.00酸性洗涤纤维/%17.41干酒糟及其可溶物5.00粗脂肪/%4.31玉米胚芽粕6.39钙/%1.03葵花皮20.00磷/%0.46玉米皮12.72钙磷比/%2.24TMR预混料2.00氧化镁0.03碳酸氢钠0.46食盐0.50石粉2.30磷酸氢钙0.30膨润土1.80注：1.每千克预混料为日粮提供：碘55 mg、锰1 750 mg、铁3 000 mg、钴25 mg、锌2 000 mg、硒22.5 mg、VA 400 000 IU、VD 30 000 IU、VE 3 000 IU。2.营养水平中钙磷比为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理试验开始当天早晨对绵羊进行空腹称重，试验期间每天打扫羊圈，定期消毒。试验羊自由饮水、采食，饲喂时间为7：00和17：00。每次饲喂前添加CLA，与日粮充分搅拌均匀后立即饲喂。预试期15 d，正式试验期60 d。1.4样品采集试验结束前1 d早上，在绵羊空腹的状态下采用颈静脉穿刺法采集血液，使用促凝管采取血液30 mL，3 000 r/min离心10 min，取其上清，置于-20 ℃冰箱保存，用于测定血清中脂代谢相关生化指标。饲养试验结束后，将所有试验羊拉到郊区屠宰场屠宰，屠宰前禁食12 h，自由饮水。绵羊宰杀后，立即从第12肋骨处采取皮下脂肪样品约100 g，迅速放于液氮中，随后放入-80 ℃冰箱保存，用于冰冻切片的制作和实时荧光定量PCR的检测。1.5测定指标及方法1.5.1生长性能记录饲喂期间绵羊的初重、末重，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。平均日采食量＝饲喂期间总采食量/(饲喂天数×绵羊只数)(1)平均日增重＝(末重－初重)/饲喂天数(2)料重比＝平均日采食量/平均日增重(3)1.5.2血清生化指标总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量等测定方法均根据南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。1.5.3TUNEL染色脂肪组织经过OTC包埋后，在冰冻切片机上进行冰冻切片的制作。将做好的切片按照博士德生物工程有限公司TUNEL试剂盒的方法步骤进行染色。随后放在荧光显微镜下观察。1.5.4凋亡相关基因表达的检测利用荧光定量PCR的方法检测脂肪组织中促凋亡基因Bax、Caspase-3、Cyt-c和抑凋亡基因Bcl-2的表达量。凋亡相关基因的引物见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.004.T003表3凋亡相关基因的引物基因引物序列（5'→3'）BaxF：GCCCTTTTGCTTCAGGGTTTR：TCAGACACTCGCTCAGCTTCCaspase-3F：TGCTTAGGAATACATTTAGAGACCAR：AGGATATTCCGGAGTCCACTGATCyt-cF：TTCAGGGTTGTCCTAAACAGGAAR：CCCCTCTAATCCTGCTGAGTTBcl-2F：GCTGAAGCGAAGCTGTAGACTR：TCCTTTGGCAGTAAGTAGCTGAgapdhF：GAGTCCACTGGGGTCTTCACR：CACAAACATGGGAGCGTCAG注：gapdh为内参。根据Takara公司RNA提取试剂盒的操作步骤提取脂肪组织中的总RNA，对RNA进行反转录，通过PCR扩增Bax、Caspase-3、Cty-c、Bcl-2和内参gapdh的cDNA。以cDNA为模板对Bax、Caspase-3、Cty-c和Bcl-2进行荧光定量PCR扩增。采用ΔΔCt法进行基因相对定量分析。1.6数据统计与分析试验所得数据采用Excel 2007进行初步整理，采用SPSS 20.0软件中的One-way ANOVA进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著，0.05P0.10表示趋于显著。2结果与分析2.1日粮中添加不同水平CLA对绵羊生长性能的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，3.5% CLA组绵羊的料重比显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.004.T004表4日粮中添加不同水平CLA对绵羊生长性能的影响组别初重/kg末重/kg平均日增重/g平均日采食量/g料重比对照组19.27±1.6337.30±3.03296.79±45.901 680.79±168.775.73±0.62a1.5% CLA组18.85±2.5338.02±4.62309.74±49.891 540.31±242.095.01±0.68a3.5% CLA组19.80±1.2839.43±2.90330.13±46.831 538.66±156.204.70±0.44b注：同列数据肩标相同或无字母表示差异不显著（P0.05），不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）；下表同。2.2日粮中添加不同水平CLA对绵羊血清生化指标的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，3.5% CLA组的LDL-C含量下降18%，趋于显著（0.05P0.10）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.004.T005表5日粮中添加不同水平CLA对绵羊血清生化指标的影响组别TCTGLDL-CHDL-C对照组1.97±0.180.29±0.040.91±0.081.21±0.081.5% CLA组1.79±0.310.30±0.030.81±0.131.21±0.113.5% CLA组1.73±0.200.29±0.040.75±0.031.14±0.12mmol/L2.3TUNEL染色结果（见图1）细胞经TUNEL荧光染色后，在荧光显微镜下观察，凋亡细胞发出黄绿色荧光，未凋亡的细胞不会发出荧光。由图1可知，1.5% CLA组和3.5% CLA组出现明显的黄绿色荧光，表明细胞发生凋亡，并且随着CLA添加水平的升高，脂肪细胞凋亡特征更加明显。图1TUNEL荧光染色结果（400×）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.004.F1a1对照组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.004.F1a21.5% CLA组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.004.F1a33.5% CLA组2.4日粮中添加不同水平CLA对绵羊脂肪细胞凋亡相关基因表达的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，1.5% CLA组的Cyt-c mRNA表达量显著下降（P0.05），Bcl-2的mRNA表达量显著提高（P0.05）。与对照组相比，3.5% CLA组中Bax、Caspase-3和Cyt-c的mRNA表达量均极显著升高（P0.01），Bcl-2的mRNA表达量极显著下降（P0.01）。与1.5% CLA组相比，3.5% CLA组中Bax、Caspase-3和Cyt-c的mRNA表达量均极显著提高（P0.01），Bcl-2 mRNA的表达量极显著下降（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.004.T006表6日粮中添加不同水平CLA对绵羊脂肪细胞凋亡相关基因表达的影响组别BaxCaspase-3Cyt-cBcl-2对照组1.08±0.09Bb1.20±0.15Bb1.43±0.13Bb0.64±0.07Ab1.5% CLA组0.96±0.14Bb1.00±0.08Bb1.03±0.13Bc1.01±0.13Aa3.5% CLA组1.53±0.05Aa1.91±0.13Aa1.97±0.21Aa0.46±0.03Bc3讨论大量试验研究CAL对动物的生长性能的影响，但研究的结果并不一致。黄金秀等[9]发现，饲喂添加CLA的日粮对猪的平均日增重并无显著影响，但随着CLA含量升高，猪的平均日增重呈下降的趋势；CLA能够显著降低猪的饲料转化率和平日均采食量。赖长华等[10]在断奶仔猪的日粮中添加不同含量的CLA，发现随着添加量的增加，平均日采食量、平均日增重和饲料转化率随之升高。本试验发现，添加3.5% CLA后，绵羊料重比显著下降，说明CLA对绵羊的生长发育有一定的促进作用。血清中TC和TG的变化可以反映脂质的吸收状况，LDL-C和HDL-C的含量能够反映机体胆固醇的代谢状况。郗艳菊[11]在对肉仔鸡脂类代谢的研究中发现，CLA能够显著降低TC、TG及LDL-C的含量。本试验研究发现，日粮中添加3.5% CLA能够显著降低血清中LDL-C的含量，与以往的研究结果一致。但是，本试验中CLA对血清中TG、TC和HDL-C的含量无显著影响，与以往的研究结果不同。造成不同的原因可能与CLA添加量、日粮组成、饲养环境以及饲养时间长短等因素有关，其具体的作用机制还有待解决。Bcl-2和Bax分别是抑凋亡基因和促凋亡基因，Bcl-2/Bax比例会影响细胞凋亡[12]。有研究发现，使用CLA处理小鼠乳腺肿瘤细胞，其抑凋亡因子Bcl-2的表达量降低，促凋亡因子Bax的表达量并无太大变化，导致Bcl-2/Bax的比值降低，从而引起细胞凋亡的发生[13]。经CLA处理的肿瘤细胞，Bcl-2 mRNA的表达量减少，Bax mRNA的表达量升高，促凋亡蛋白Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3 mRNA的表达量均有提高，从而导致细胞的凋亡[14]。袁贤琳等[15]发现，乳腺癌细胞MCF-7经过CLA单体c9，t11-CLA和t10，c12-CLA处理过后，Bax蛋白含量显著增加，而Bcl-2蛋白的表达显著降低，导致细胞的凋亡。本试验研究发现，在饲料中添加3.5% CLA能够显著增加脂肪细胞中Bax的表达量，并减少Bcl-2的表达量，导致细胞内Bcl-2/Bax的比值降低，从而促使脂肪细胞发生凋亡。Caspase家族是细胞凋亡途径中的重要组成部分，其中Caspase-3起到关键性的作用，在细胞凋亡的3个途径中均有参与。黄桂东[16]使用CLA处理Caco-2细胞，发现Caspase-3酶的表达显著增加，促使细胞发生凋亡。使用CLA处理Caco-2细胞，Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的酶活及mRNA的表达量增加，促进细胞发生凋亡，进而抑制Caco-2细胞的增多[17]。本试验研究发现，在日粮中添加3.5% CLA能够显著增加脂肪细胞中Caspase-3的表达量，从而导致脂肪细胞发生凋亡。在细胞凋亡途径中，线粒体通过释放Cyt-c起到中心调控作用，可以导致细胞凋亡的发生。本试验发现，3.5% CLA组的Cyt-c表达量显著高于对照组，促使脂肪细胞发生凋亡，与以往研究的脂肪细胞凋亡的机制相同。但是，在日粮中添加1.5% CLA，促凋亡基因Bax、Caspase3和Cyt-c的表达量均降低，抑凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达升高，原因可能与饲喂时间较短和CLA添加量较少等因素有关，其具体的作用机制有待进一步研究。4结论本试验条件下，日粮中添加3.5% CLA可以促进脂肪细胞的凋亡。