罗非鱼链球菌病是罗非鱼养殖中常见的流行性疾病，严重危害罗非鱼养殖业的健康发展[1-2]。该病主要的病原菌为海豚链球菌（Streptococcus iniae）和（Streptococcus agalactiae）无乳链球菌两种[3]。无乳链球菌呈革兰氏阳性（G+），过氧化氢酶呈阳性，在绵羊血琼脂板上呈β溶血[4]。链球菌的主要致病因子有荚膜多糖、β溶血素、葡糖磷酸变位酶、CAMP因子、α烯醇、C5α肽、SiM蛋白等[5-7]。目前，防治罗非鱼链球菌病时，更多使用化学药物。使用抗生素防治链球菌病虽然方便、见效快，但是容易引起环境污染、产生耐药性及产品药物残留等问题[8-10]，对罗非鱼产业的健康发展产生不利影响[11]。中草药为天然药物，是含有抗菌、抗病毒、增强免疫等多重功效的活性化合物，具有毒副作用小、价格低、易于代谢等特点[12]。Zilberg等[13]发现，使用迷迭香混饲投喂海豚链球菌感染的罗非鱼，其治疗效果与土霉素相当。邓恒为[14]制备75种中草药粗提液进行体内外抑菌试验，发现其抑菌效果明显。迄今为止，国内外对罗非鱼链球菌病无有效的防治措施[15]。目前，越来越多的学者致力于用中草药防治罗非鱼链球菌病，并发现中草药具有不同程度的抑菌作用[16]。近年来，植物多糖常作为免疫增强剂应用于水产动物的免疫调节和疾病防治中。山豆根多糖作为新型免疫调节剂广受学者重视，关于山豆根药理活性的研究也多集中在免疫调节、抗氧化及抗肿瘤方面[17]，对水产动物免疫调节方面的研究较少。本试验比较在基础饲料中添加不同水平的山豆根多糖对人工感染无乳链球菌罗非鱼的保护率，评价山豆根多糖在罗非鱼疾病防护中的作用。1材料与方法1.1试验材料山豆根多糖（SSP）由广西大学动物科学技术学院药理实验室分离提取。黄芪多糖（APS）由艾迪森生物科技有限公司生产（兽药字（2016）010125236），生产批号为1705101。罗非鱼膨化配合饲料购自通威股份有限公司。无乳链球菌GX107由广西壮族自治区水产科学研究院鱼病室分离、鉴定、保存。吉富罗非鱼由广西水产研究所国家级罗非鱼良种场提供。血平板BA购自广东环凯，生产批号为H0072Y。BHI和革兰氏染液购自（北京）路桥，生产批号分别为200820、170207。Agar Powde购自Solarbio，批号为1108s031。四季青®胎牛血清购自浙江天杭生物，生产批号为20170726。TIANGEN® TIANamp Bacteria DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、RNaseA、溶菌酶、2×Taq Mix、RNA Free Wter均为（北京）天根生化科技有限公司产品。1.2试验方法1.2.1试验设计选择613尾（73.63±4.03）g、规格均匀的吉富罗非鱼，随机抽取5尾鱼，剖取脑组织进行链球菌分离培养，结果呈阴性，可用于后续试验。按药物/饲料的质量百分比称取相应的山豆根多糖和黄芪多糖溶于灭菌纯化水与饲料混匀，晾干，备用。试验选取吉富罗非鱼608尾。将其中的128尾罗非鱼随机分成8组，每组4个重复，每个重复4尾鱼。GX107的LD50测定试验分组及处理见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.016.T001表1GX107的LD50测定试验分组及处理组别处理1组胸腔注射4.52×104 CFU/mL的无乳链球菌GX1072组胸腔注射7.24×104 CFU/mL的无乳链球菌GX1073组胸腔注射3.62×105 CFU/mL的无乳链球菌GX1074组胸腔注射1.81×106 CFU/mL的无乳链球菌GX1075组胸腔注射9.04×106 CFU/mL的无乳链球菌GX1076组胸腔注射4.52×107 CFU/mL的无乳链球菌GX1077组胸腔注射2.26×108 CFU/mL的无乳链球菌GX1078组胸腔注射2.26×109 CFU/mL的无乳链球菌GX107480尾吉富罗非鱼用于山豆根多糖对链球菌病的预防试验，具体分组及处理见表2。将480尾吉富罗非鱼，随机分为6组，每组4个重复，每个重复20尾，每天按鱼体重的5%分3次（9：00、12：00、18：00）进行投料。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.016.T002表2山豆根多糖对链球菌病的预防试验分组及处理组别不同处理空白对照组80尾罗非鱼连续投喂基础饲料30 d，随机抽取42尾罗非鱼，每尾胸腔注射0.2 mL生理盐水，20 d后进行采样感染对照组80尾罗非鱼连续投喂基础饲料30 d，随机抽取42尾罗非鱼，每尾胸腔注射0.2 mL 3.45×107 CFU/mL GX107，20 d后进行采样0.1% SSP组80尾罗非鱼连续投喂含0.1%山豆根多糖的饲料30 d，随机抽取42尾罗非鱼，每尾胸腔注射0.2 mL 3.45×107 CFU/mL GX107，20 d后进行采样0.2% SSP组80尾罗非鱼连续投喂含0.2%山豆根多糖的饲料30 d，随机抽取42尾罗非鱼，每尾胸腔注射0.2 mL 3.45×107 CFU/mL GX107，20 d后进行采样0.4% SSP组80尾罗非鱼连续投喂含0.4%山豆根多糖的饲料30 d，随机抽取42尾罗非鱼，每尾胸腔注射0.2 mL 3.45×107 CFU/mL GX107，20 d后进行采样0.4% APS对照组80尾罗非鱼连续投喂含0.4%黄芪多糖的饲料30 d，随机抽取42尾罗非鱼，每尾胸腔注射0.2 mL 3.45×107 CFU/mL GX107，20 d后进行采样1.2.2无乳链球菌GX107的鉴定菌种划线接种于绵羊血琼脂培养基（BA）平板表面，28 ℃培养20 h，挑取典型单个菌落划线接种于BHIA平板，置于32 ℃培养24 h，出现典型菌落后重复纯化培养2~3次。挑取BA平板单个典型菌落进行革兰氏染色，镜检观察并记录结果，蓝紫色为G+，红色为G-。挑取BHIA平板上的单个菌落涂抹于玻璃片上，滴加新鲜配制的4.5%过氧化氢溶液1滴，观察记录结果，1 min内产生大量气泡为阳性，反之为阴性。1.2.3细菌DNA提取挑取BHIA平板上的单个菌落接种于5%血清BHI肉汤培养基中，30 ℃，150 r/min培养30 h，取1.5 mL菌液10 000 r/min离心1 min，弃上清，按TIANGEN® TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒说明提取细菌DNA，样品保存于-20 ℃冰箱内，用于细菌DNA的PCR扩增。1.2.4双重PCR扩增参考王均等[18]建立的海豚链球菌-无乳链球菌双重PCR检测方法，进行PCR扩增及电泳验证。海豚链球菌16S-23SITS靶序列特异性引物：（F：5'-GAAAATAGGAAAGAGACGCAGTGTC-3'；R：5'-CC TTATTTCCAGTCTTTCGACCTTC-3'）；无乳链球菌16S-23S rDNA靶序列特异性引物：（Sdi61：5'-AGG AAACCTGCCATTTGCG-3'；Sdi252：5'-CAATCTATT TCTAGATCGTGG-3'）。PCR反应体系50 μL：DNA模板5 μL，2×Taq Mix 25 μL，上下游引物各1.25 μL，Sdi61、252各1.25 μL，RNase-Free Water补足至50 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、2 min，35个循环；72 ℃延伸2 min。PCR扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳。1.2.5无乳链球菌GX107的LD50测定按照表1的分组处理对罗非鱼进行胸腔注射攻毒，每尾0.2 mL；攻毒后每2天换水2/3，水温控制在（27.5±1.5）℃，每天按试验鱼体重3%的饵量，分两次定时投喂。攻毒后连续观察14 d，每天记录试验鱼的进食、发病症状及死亡数，使用BA血平板对濒临死亡和死亡试验鱼进行细菌分离鉴定。使用Karber氏法测定无乳链球菌GX107的半数致死量（LD50）。1.2.6山豆根多糖对链球菌病的预防效果观察按照表2的分组处理进行试验，试验期间水温保持（27.5±1.5）℃，每天换水2/3，每天按试验鱼体重3%的饵量投喂。攻毒后观察20 d，每天记录罗非鱼临床表现、发病症状及死亡数，濒临死亡和已经死亡的试验鱼无菌剖取脑和肝脏组织物，划线接种于血平板BA上，第20 d剩下的鱼全部处死，取脑组织接种BA进行细菌分离鉴定，以确定发病率并计算药物有效率。药物有效率=(存活数/感染数)×100%(1)1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS Statistics V21.0软件进行单因素方差分析和LSD多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1无乳链球菌GX107的鉴定结果2.1.1形态鉴定（见图1）由图1可知，无乳链球菌GX107菌株与感染罗非鱼后分离菌株经30 ℃恒温培养24 h，在血平板BA上，无乳链球菌GX107菌株直径为1~2 mm的圆形，乳白色，凸起菌落，其边缘整齐，菌落周围环绕1圈2~4 mm宽的透明溶血环，为典型的β溶血环。在BHIA培养基上生长24 h的无乳链球菌GX107菌落为灰白色或白色，直径较小的湿润凸起菌落。革兰氏染色后镜检观察到BA或BHIA固体培养基上的无乳链球菌菌株为深紫色的阳性球菌，呈现单个、双个或长短不一的串珠状排列。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.016.F001图1无乳链球菌GX107的形态鉴定2.1.2生化鉴定-H2O2酶检测（见图2）由图2可知，无乳链球菌GX107在血平板BA和BHIA上培养24 h以内，过氧化氢酶试验呈阴性，培养时间超过24 h或培养基表面的菌落生长过密时，过氧化氢酶试验为阳性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.016.F002图2无乳链球菌GX107的过氧化物酶试验2.1.3病原菌双重PCR鉴定结果（见图3）对病原菌提取的基因组DNA进行双重PCR扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶检测。由图3可知，在192 bp附近出现明亮的目的条带，基本确定本试验所复苏菌株与感染后分离菌株为无乳链球菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.016.F003图3罗非鱼病原菌双重PCR鉴定结果（部分）注：M为MarkerⅠ；1为ddH2O；2~7为GX107；8为0.5%血清BHI培养基。2.2人工感染试验结果2.2.1病鱼临床症状（见图4）由图4可知，感染无乳链球菌的罗非鱼体色发黑，眼球外凸发白浑浊，死鱼的鳍条基部及鳃盖充血，解剖发现肝脏、脾脏、肾脏、胆均有不同程度地水肿，部分出现腹内积水。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.016.F004图4罗非鱼链球菌病解剖图2.2.2无乳链球菌GX107对罗非鱼的LD50试验结果（见表3）由表3可知，利用寇氏法计算无乳链球菌GX107对罗非鱼半数致死量LD50，得出复壮的无乳链球菌GX107半数致死量LD50=6.61×105 CFU/mL，标准误sm=0.249 567 739，LD50的95%可信限为2.14×105~2.04×106 CFU/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.016.T003表3无乳链球菌GX107对罗非鱼的LD50试验结果（n=16）组别剂量/(CFU/mL)剂量对数Logd(X)死亡数/尾死亡率（P）/%P2P-P21组4.52×1044.655 100002组7.24×1044.859 7212.5 00.015 60.109 43组3.62×1055.558 7531.2 50.097 70.214 84组1.81×1066.257 7637.5 00.140 60.234 45组9.04×1066.956 21062.5 00.390 60.234 46组4.52×1077.655 11275.0 00.562 50.187 57组2.26×1088.354 11593.7 50.878 90.058 68组2.26×1099.354 116100.0 01.000 00∑P=412.5 0∑P-P2=1.039 12.2.3山豆根多糖对罗非鱼链球菌病的预防效果（见表4）由表4可知，空白对照组罗非鱼未出现死亡，保护率为100%。无乳链球菌感染对照组罗非鱼死亡率为85.71%，极显著高于0.1%、0.2%山豆根多糖和0.4% APS组（P0.01）。与感染对照组相比，给药组在一定程度上降低了无乳链球菌感染罗非鱼导致的死亡率，以0.2%山豆根多糖组和0.4%APS组保护率最高，达61.90%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.016.T004表4山豆根多糖对罗非鱼链球菌病的预防效果组别死亡率保护率空白对照组0100感染对照组85.71±14.29Aa14.29±14.29Bc0.1% SSP组54.76±17.98Bbc45.24±17.98Aab0.2% SSP组38.10±4.12Bc61.90±4.12Aa0.4% SSP组66.67±10.91ABab33.33±10.91ABbc0.4% APS组38.10±10.91Bc61.90±10.91Aa注：同列数据肩标字母相同表示差异不显著（P0.05），小写字母不同表示差异显著（P0.05），大写字母不同表示为差异极显著（P0.01）。%3讨论无乳链球菌是目前危害罗非鱼养殖最严重病原菌之一[18-19]。无乳链球菌的致病机理尚不明确，尚无特异性的防治药物，抗生素成为链球菌病暴发时常用的治疗手段[20-21]。而抗生素在治疗鱼病的同时所造成的环境污染、耐药性、药物残留等问题严重威胁罗非鱼产业的健康发展[22]。2012年，广西某养殖场利用三黄散和黄芪多糖恢复罗非鱼受损的肝脏、提高机体免疫力，从而降低罗非鱼链球菌病的死亡率[23]。海豚链球菌与无乳链球菌常混合感染可长期存在于水体环境中，所以本次试验在病原菌鉴定上采用同时鉴定海豚链球菌与无乳链球菌的PCR检测方法，并设置空白对照组，旨在评估试验环境的安全性与稳定性。结果显示，空白对照组未出现1例死亡，说明试验环境基本安全，试验结果出现的罗非鱼死亡由人工感染链球菌导致。本试验中，无乳链球菌感染组罗非鱼感染无乳链球菌死亡率为85.71%；药物处理组罗非鱼死亡率有所降低，对病鱼的有效保护率有所提高，但并未呈现规律性；0.2%山豆根多糖处理组罗非鱼死亡率与黄芪多糖组一致，其药物有效保护率也与黄芪多糖等效，对人工感染无乳链球菌的罗非鱼保护率达61.9%；随着山豆根多糖剂量的增加，0.4%山豆根多糖处理组对罗非鱼链球菌病的保护率不再加强，且低于0.2%山豆根多糖组。原因可能为0.2%山豆根多糖组对罗非鱼链球菌病保护率出现最大剂量效应，若此时增加山豆根多糖的添加量，效应不再加强，反而出现对罗非鱼链球菌病的保护率降低的现象，符合量效关系。而0.2%山豆根多糖能增强罗非鱼的特异性免疫来防御链球菌的入侵，提高保护率。曹迷霞等[24]发现，山豆根多糖能够提高PCV2感染免疫细胞的增殖活性。帅学宏[25]研究山豆根多糖对小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的影响，发现山豆根多糖可以增强机体细胞的免疫反应，达到提高免疫力的作用。上述研究表明，山豆根多糖可通过增强机体的免疫功能提高机体的抗病力。在本研究人工感染试验中发现，饲料中添加山豆根多糖能够提高人工感染无乳链球菌的罗非鱼保护率，降低死亡率。因此，推测山豆根多糖能够通过提高罗非鱼机体的免疫功能来抵抗无乳链球菌对机体的致病力，其作用机制有待进一步深入研究。4结论饲喂不同剂量的山豆根多糖对链球菌感染的罗非鱼具有不同程度的保护作用，能够提高罗非鱼体内的免疫力，降低死亡率。0.2%的山豆根多糖添加量最为经济高效，连用30 d为宜。