酸马奶（koumiss）中含有非常丰富的微生物资源，可以治疗，如高血压、糖尿病、十二指肠溃疡、细菌性痢疾等多种疾病，乳酸菌（lactic acid bacteria）在其中发挥着重要的作用[1-3]。乳酸菌是一类菌落的统称，可以发酵碳水化合物，产生大量乳酸，具有极高的研究价值。乳酸菌在自然界种类繁多、分布广泛。大部分乳酸菌为动物体内不可缺少的具有重要生理功能的活性微生物，可以产生抗菌物质，从而抑制或除去病原体，与动物相辅相成，是对环境友好的益生菌[4]。在养殖业中，在饲料中添加乳酸菌可以提高饲料的质量和营养含量，提高饲料的利用率。Ertekin等[5]研究表明，在苜蓿青贮饲料中添加乳酸菌可以提高苜蓿青贮饲料的代谢能和有机质消化率。采用16S rRNA基因序列方法对乳酸菌进行分类，已经成为当今使用最多的方法[6]。研究微生物的种类有利于发掘生物多样性、微生物类群多样性、生态类型多样性、遗传多样性[7]。目前，马奶中乳酸菌的研发仍处于初级阶段。本研究对采自内蒙古锡林郭勒阿巴嘎旗牧户新鲜酸马奶样品中的乳酸菌进行分离鉴定，同时采用高通量测序技术对其进行菌群分析，以期为工业化生产酸马奶提供乳酸菌资源。1材料与方法1.1试验材料1.1.1酸马奶样品来源新鲜酸马奶样品采自锡林郭勒阿巴嘎旗牧户。将样品置于无菌容器内，低温带回实验室，4 ℃冰箱保存。1.1.2培养基与试剂培养基：MRS固体培养基、MRS液体培养基、营养琼脂培养基和营养肉汤，由深市环凯微生物科技有限公司生产。试剂：PBS保护液、PBS缓冲液、脱脂乳保护器、PCR扩增和电泳所用试剂。1.1.3仪器设备SW-CJ-2D经济型双人单面垂直净化工作台（北京东南议诚实验室设备有限公司）、LDZM-40KCS型立式压力蒸汽灭菌器（上海中安医疗器械厂）、ZXSD-B1090型生化培养箱（青岛海尔股份有限公司）、3K15型高速离心剂（德国Sigma公司）、CP224C型分析电子天平（沪市奥豪斯仪器有限公司）、ZWY-100H型振荡器（沪市志诚分析仪器制造有限公司）、pH计（美特乐拓粒朵仪器（上海）有限公司）。采样箱、游标卡尺等。1.2试验方法1.2.1酸马奶中乳酸菌的分离、纯化及保存吸取0.2 mL 10倍稀释酸马奶稀释液均匀涂布于已制备好的MRS固体培养基上，将平板倒置于厌氧培养箱内37 ℃厌氧培养48 h。菌落形成后，随机挑取出形态特征不同、透明环状的单个菌落于相应的液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h。不纯的菌株在MRS固体培养基上划线分离，37 ℃厌氧培养48 h，如此反复纯化3~4次，转移至MRS液体培养基中增殖，进行纯化培养[8]。对纯化好的菌液进行菌群鉴定。1.2.2高通量测序技术鉴定酸马奶中乳酸菌以提纯的DNA为模板对细菌的16S rDNA基因区进行PCR扩增，高通量测序引物序列见表1。PCR扩增体系见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.018.T001表1高通量测序引物序列类型区域引物名称引物序列（5'→3'）细菌16SV3+V4341FCCTAYGGGRBGCASCAG806RGGACTACNNGGGTATCTAAT10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.018.T002表2PCR扩增体系体系成分取量5×FastPfu4 μL2.5mM dNTPs0.2 μLForward Primer（5 μmol/L）0.8 μLReverse Primer（5 μmol/L）0.8 μLFast Pfu Polymerase0.4 μLTemplate DNA（100 mg/L）10 μgddH2O补至20 μLPCR循环参数为95 ℃、2 min（预变性）；95 ℃、30 s（变性），55 ℃、30 s（退火），72 ℃、30 s（延伸），25个循环；72 ℃、5 min（末端延伸）。1.2.3筛选具有抑菌活性的乳酸菌1.2.3.1抑菌活性的测定将已纯化的乳酸菌菌株接种于MRS肉汤培养基，37 ℃恒温振荡培养24 h，10 000 r/min低温离心15 min，收集无细胞发酵上清液，过滤，4 ℃冰箱保存，备用。采用牛津杯法测无细胞发酵上清液的抑菌活性。使用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌。1.2.3.2有机酸抑菌作用的排除将无细胞发酵上清液的pH值调至7.0，检测其抑菌活性。抑菌活性的测定方法同1.2.3.1。以未经处理的发酵上清液做对照。1.2.3.3H2O2抑菌作用的排除将过氧化氢酶加入无细胞发酵上清液中（pH值为7.0），调节浓度至1 g/L。将此上清液混合均匀，37 ℃水浴3 h，检测其抑菌活性。抑菌活性的测定方法同1.2.3.1。以未经处理的发酵上清液为对照。1.2.3.4蛋白酶敏感试验取4份等量无细胞发酵上清液，将pH值调至7.4、7.4、6.0、2.0，分别加入等量蛋白酶，调节浓度至1 g/L。将此上清液混合均匀，37 ℃水浴3 h，检测其抑菌活性的变化。抑菌活性的测定方法同1.2.3.1。以未经处理的发酵上清液做对照。2结果与分析2.1酸马奶中乳酸菌16S rDNA鉴定2.1.1OTU分析本研究从新鲜酸马奶中分离得到的16株乳酸菌中挑选出5株进行16S rDNA鉴定。为研究各样本的物种组成，对所有样本的effective tags，以97%的一致性（identity）进行OTUs（operational taxonomic units）聚类，对OTUs的代表序列进行物种注释。结果表明，5种菌均属于乳酸菌，占比均较高，分别占97%、94%、91%、98%和92%，说明培养纯化出了纯度较高的乳酸菌。2.1.2物种相对丰度（见图1~图6）根据物种注释结果，选取每个样本或分组在各分类水平（门、纲、目、科、属、种）上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各样本在不同分类水平上相对丰度较高的物种及其比例。由图1~图6可知，所测5种菌在门、纲、目、科、属水平上占比最大优势菌群均相同，在种水平上出现了区别。菌1、菌2、菌3、菌5为戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus），菌4为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.018.F001图1酸马奶中乳酸菌优势菌群在门水平上的相对含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.018.F002图2酸马奶中乳酸菌优势菌群在纲水平上的相对含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.018.F003图3酸马奶中乳酸菌优势菌群在目水平上的相对含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.018.F004图4酸马奶中乳酸菌优势菌群在科水平上的相对含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.018.F005图5酸马奶中乳酸菌优势菌群在属水平上的相对含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.018.F006图6酸马奶中乳酸菌优势菌群在种水平上的相对含量2.2乳酸菌抑菌活性的测定（见图7、图8）由图7可知，1号菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为17.20 mm和16.95 mm，2号菌株为13.01 mm和16.50 mm，3号菌株为15.95 mm和14.05 mm，4号菌株为14.23 mm和16.32 mm，5号菌株为16.33 mm和15.21 mm。1号菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，其次为5号菌株。但5株菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌作用。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌显现较好抑菌效果的1号菌株和5号菌株进行了有机酸和H2O2抑菌作用排除试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.018.F007图7乳酸菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用由图8可知，排除有机酸和H2O2的抑菌作用后，1号菌株仍有一定的抑菌作用，5号菌株没有显现出抑菌效果，说明1号菌株的抑菌活性不仅来自有机酸和H2O2，还有其他成分发挥抑菌作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.018.F008图81号菌株有机酸和H2O2抑菌作用排除试验结果2.3蛋白酶敏感性的测定（见图9）对1号菌株进一步进行抗菌物质的蛋白质敏感试验，以此确定这些物质是否具有蛋白质性质。由图9可知，以不同蛋白酶处理1号菌株上清液，此上清液在胃蛋白酶和蛋白酶K的作用下完全失去抑菌作用，而在胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的作用下仍显现抑菌作用，说明此菌株抗菌物质中存在活性蛋白或多肽物质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.018.F009图91号菌株蛋白酶敏感试验结果3讨论不同地区酸马奶样品中的乳酸菌组成会因天气、气候、地形地貌、季节等各种因素而具有一定的差异。同一地区的样品也会因制作工艺及采样时间而有较大差异。本研究利用16S rDNA序列分析法结合特异性PCR分析锡林郭勒阿巴嘎旗牧户家庭新鲜酸马奶中乳酸菌的组成及结构。结果显示，在酸马奶样品的16株疑似乳酸菌中分离得到5株纯度较高的乳酸菌。通过高通量测定技术，鉴定4株为戊糖乳杆菌，1株为干酪乳杆菌，说明戊糖乳杆菌可能是锡林郭勒地区酸马奶乳酸菌的优势菌种。近年来，酸马奶中菌种特性和菌群的研究报道较多。刘文俊等[9]对蒙古国酸马奶的多样性进行研究，发现干酪乳杆菌为优势菌种。张兴吉[10]对西部牧区（青海、甘肃、新疆、西藏和内蒙古）进行乳酸菌发酵特性研究，并比较不同地区之间的优势菌种，发现干酪乳杆菌和戊糖乳杆菌是西藏和新疆的优势菌种。干酪乳杆菌和戊糖乳杆菌均具有良好的抑菌作用，干酪乳杆菌对一些低温细菌和腐败菌有很好的抑制效果[11]，均为可开发利用的潜力有益菌。抗菌肽又称抗微生物肽，是1类在细菌代谢过程中通过核糖体合成机制产生的，具有抑菌活性的蛋白质或多肽类物质。它们可以抑制部分乳酸菌，还可以抑制一些其他细菌。乳酸菌抗菌肽是安全的物质，在体内能够抑制病原微生物的生长繁殖，增强机体免疫功能。抗菌肽具有广谱和高效的抗菌活性，被广泛用作动物饲料添加剂。Shen[12]研究表明，抗菌肽饲料添加剂能够显著提高鸡的成活率，增加鸡的体重，对金黄色葡萄球菌引起的疾病有较好的治疗作用。目前，对乳酸链球菌素（nisin）的研究比较深入，对其他细菌素相关研究报道甚少，在世界范围内已研究确认40多种乳酸菌细菌素，它们的生化特性、敏感范围及作用方式均具有很大差异，是复杂的拮抗物[13]。根据现代试验分析方法可以确定酸马奶中含有有益于人体健康的成分，如氨基酸、乳酸、矿物质、蛋白质、维生素、脂肪等[14]。酸马奶拥有广阔的市场，但我国对酸马奶产业化还处于研究与探索阶段[15]。本研究仅限于微生物体系，未形成规模，在生产中的应用与作用需要进一步深入研究。4结论本研究使用传统稀释法从新鲜酸马奶样品中分离鉴定出16株疑似乳酸菌。通过16S rDNA测序技术鉴定出纯度较高的5株乳酸菌，其中4株为戊糖乳杆菌，1株为干酪乳杆菌。本研究结果表明，戊糖乳杆菌很可能是锡林郭勒地区酸马奶中的优势菌种。5株菌株均具有较好的抑菌作用，其中1株在胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的作用下仍保持抑菌活性，说明此菌株能够产生抗菌蛋白类代谢物。