甘露聚糖作为半纤维素，含量高、分布广泛，其抗营养作用一直受到人们的重视[1]。畜禽不具有分泌甘露聚糖酶的消化酶系，在饲料中添加甘露聚糖酶是解决这一问题的主要途径。β-甘露聚糖酶是半纤维素水解酶，内切后可以降解含有β-1，4糖苷键的甘露聚糖[2-3]，具有降解一般非淀粉多糖（NSP）的作用，可以降解豆类籽实中的多糖成分，生成低聚糖如甘露寡糖，促进动物对营养物质的消化吸收[1-3]。赵敏[4]、何科林[5]和廖睿[6]在体外模拟NSP酶对畜禽日粮消化的作用效果，结果表明，NSP酶对畜禽还原糖释放量、日粮代谢能具有明显的递增效应。余璐璐等[7]发现，仿生消化试验中酸性与中性β-甘露聚糖酶酶活比为1∶1时，日粮还原糖释放量最高。目前，β-甘露聚糖酶的饲用开发主要有体外模拟消化和动物试验，体外模拟消化因效果稳定且试验周期较短，普遍应用于前期筛选。源自毛壳菌的中性甘露聚糖酶基因和黑曲霉的酸性甘露聚糖酶基因所表达的β-甘露聚糖酶是目前产业化的β-甘露聚糖酶主要类型[1-3]。二者的酶学性质和应用效果差异极其明显。本研究旨在通过体外模拟消化法评估这两种β-甘露聚糖酶不同活力组合的效果，开发复合型β-甘露聚糖酶产物，为β-甘露聚糖酶在畜牧行业的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌株酸性甘露聚糖酶的基因源自黑曲霉，中性甘露聚糖酶的基因源自毛壳菌，二者的异源表达载体和毕赤酵母GS 115基因工程菌均由本实验室前期构建和保存。1.1.2试剂和原料甘露聚糖G0753、胃蛋白酶P7000、糜蛋白酶A0164和淀粉酶A3306，均购自Sigma公司；胰蛋白酶0785购自Amresco公司；其他试剂均为国产分析纯化。玉米粉、酒糟、大米粉、小麦粉、鱼粉、米糠、豆粕和麦麸，均由昆明爱科特生物科技有限公司赠送。1.1.3培养基YPD培养基：蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖20 g/L。高密度发酵培养基：每升发酵培养基包含40 mL甘油、5.0 mL H2SO4、基础盐培养基（26.7 mL 85% H3PO4、0.93 g CaSO4、18.2 g K2SO4、14.9 g MgSO4·7H2O和4.13 g KOH）、微量矿物混合物（6.0 g CuSO4·5H2O、0.08 g NaI、3.0 g MnSO4·H2O、0.2g Na2MoO4·2H2O、0.02 g H3BO3、0.5 g CoCl2、20.0 g ZnCl2和65.0 g FeSO4·7H2O）和维生素混合物（128 mg C6H12O6、12.8 mg C18H32CaN2O10、12.8 mg C8H9NO3·HCl、64 mg K2HPO4、3.2 mg VB1、0.2 g VB3和12.8 mg D-生物素）。1.1.4试验仪器pH仪和分析天平（Mettler-Toledo公司，瑞士）、高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）、50 L半自动发酵罐（上海国强生化工程装备有限公司）、酶标仪（Bio-Rad公司，美国）、冷冻干燥机（Labogene公司，丹麦）。1.2试验方法1.2.1甘露聚糖酶酶粉的制备超净工作台中分别接种已活化的酸性、中性甘露聚糖酶毕赤酵母基因工程菌GS 115于200 mL YPD培养基中，30 ℃、220 r/min培养24 h，转至2 L YPD培养基中继续培养，直至细胞湿重达20 g/L。将种子液接种于含有25 L经121 ℃灭菌30 min的发酵培养基的50 L发酵罐中，使用20%质量浓度的氨溶液调节pH值约4.7。为促进巴斯德毕赤酵母的生长，第一阶段进行甘油流加培养，控制发酵参数为30 ℃、250 r/min、30 L/min和0.05 MPa，发酵24 h，直至湿重达40.0 g/L。当溶解氧（DO）含量达到100%饱和时，保持4 h，注入20 mL/h甲醇诱导产酶。在恒定的DO（20%~30%）下添加20%（体积分数）氨水控制pH值，这一阶段使用DO级联模式进行，搅拌速度调至300~400 r/min，进口空气为40 L/min，持续96 h。发酵结束后，发酵液离心，弃去菌体，对上清液进行30倍体积的浓缩，浓缩液加入200 g淀粉，冷冻干燥，获得甘露聚糖酶酶粉。复合型β-甘露聚糖酶酶粉按照酸性与中性β-甘露聚糖酶的酶活力比分别为1∶0、7∶3、5∶5、3∶7和0∶1混合，分别使用A、A7B3、A5B5、A3B7和B表示。1.2.2甘露聚糖酶酶学特性的测定酶活测定采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS）法[8]。pH值5.5、37 ℃下，每分钟从3 g/L的甘露聚糖溶液中生成1 μmol还原糖所需的酶量为1个酶活力单位，以U/mL表示。测定最适pH值：37 ℃下，稀释至较适倍数的酶液在pH值1.5~12.0进行酶促反应。测定最适温度：最适pH值下，稀释至较适倍数的酶液在20~80 ℃进行酶促反应。测定pH值稳定性：使用pH值2.0~12.0的缓冲液将酶液稀释至较适倍数，37 ℃下耐受1 h，耐受结束后同样在37 ℃下，pH值5.5时测定性质。测定温度半衰期：将稀释至较适倍数的酶液在70 ℃和80 ℃耐受3、5 min，结束后在37 ℃下pH值5.5时进行酶促反应，该温度下的半衰期以相对剩余酶活降到50%时的耐受时间来定义。以不做特殊处理的相同稀释倍数酶液作100%对照。1.2.3体外法评估甘露聚糖酶稳定性的测定测定制粒的热稳定性：水浴法模拟饲料制粒的时间和温度，在85、80、75 ℃下处理甘露聚糖酶3、5 min，在pH值5.5和37 ℃下进行酶促反应。人工猪胃消化液中的稳定性：取100 mL人工猪胃消化液（pH值3.0，737.50 U/mL胃蛋白酶、100.00 mmol/L NaH2PO4、67.11 mmol/L KCl、88.64 mmol/L NaCl）[9]，添加1 g甘露聚糖酶粉，在40 ℃分别孵育1、2、3、4 h，测定相对剩余甘露聚糖酶活力。人工猪小肠消化液中的稳定性：取100 mL猪小肠消化液（pH值7.15，760.51 U/mL胰蛋白酶、89.16 U/mL糜蛋白酶、2 435.81 U/mL淀粉酶、4.00 mmol/L青霉素钠盐、194.67 mmol/L NaH2PO4、225.13 mmol/L Na2HPO4）[9]，添加1 g甘露聚糖酶粉，在40 ℃分别孵育4、8、12、16 h，测定相对剩余甘露聚糖酶活力。以不做处理的相同稀释倍数酶液作100%对照。1.2.4体外模拟甘露聚糖酶水解饲料底物的测定模拟体外未处理组：锥形瓶中加入50 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH值5.5，0.1 mol/L），称取1 g甘露聚糖酶酶粉和5 g不同的饲料原料，37 ℃摇床反应16 h，5 000 r/min离心10 min，DNS法测定上清还原糖含量，以加入灭活酶粉（105 ℃处理1 h）对照组作为100%。体外模拟消化液处理组：缓冲液换成人工猪胃消化液，反应4 h，调节反应体系的pH值至7.15，加入与人工猪小肠消化液等量的胰蛋白酶和糜蛋白酶、淀粉酶以及青霉素，水解16 h。其他过程与未处理组一致。2结果与分析2.1甘露聚糖酶酶粉的制备通过50 L的小型发酵罐对两种甘露聚糖酶毕赤酵母基因工程菌进行高密度深层发酵。酸性甘露聚糖酶发酵上清液酶活为1 082 U/mL；中性甘露聚糖酶发酵上清液酶活为13 560 U/mL，酶活是酸性甘露聚糖酶的12.53倍。将两种甘露聚糖酶液浓缩，冻干，收集酶粉，酸性甘露聚糖酶酶粉活为54 100 U/g，中性甘露聚糖酶酶粉为324 600 U/g。将二者根据活性比统一稀释到50 000 U/g进行5种甘露聚糖酶的配比，A（酸性甘露聚糖酶50 000 U/g）、A7B3（酸性甘露聚糖酶35 000 U/g+中性甘露聚糖酶15 000 U/g）、A5B5（酸性甘露聚糖酶25 000 U/g+中性甘露聚糖酶25 000 U/g）、A3B7（酸性甘露聚糖酶15 000 U/g+中性甘露聚糖酶35 000 U/g）和B（中性甘露聚糖酶50 000 U/g）。2.25种配比甘露聚糖酶的基本酶学特性（见表1）由表1可知，酸性甘露聚糖酶最适pH值为3.5，最适温度为70 ℃，在pH值2.5~6.0的酸性条件下比较稳定，适合畜禽肠道环境的作用，具有较好的热稳定性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.019.T001表15种配比甘露聚糖酶的基本酶学特性项目AA7B3A5B5A3B7B最适pH值3.54.05.05.56.0最适温度/℃7065656050相对剩余酶活70%的pH值范围2.5~6.02.5~7.03.0~9.04.0~9.04.5~9.070 ℃半衰期/min14010065453580 ℃半衰期/min453520128中性甘露聚糖酶最适pH值为6.0，最适温度为50 ℃，在pH值4.5~9.0条件下比较稳定，是典型的中性甘露聚糖酶，温度稳定性不如酸性甘露聚糖酶。不同比例混合的甘露聚糖酶（A7B3、A5B5和A3B7）酶学特性介于二者之间。其中，甘露聚糖酶A5B5的pH值稳定范围更宽。2.3甘露聚糖酶水浴法模拟制粒温度稳定性的评估（见表2）由表2可知，酸性甘露聚糖酶在75~85 ℃处理3~5 min相对剩余酶活均在80%以上，酶活损失不到20%，酸性甘露聚糖酶的耐热性较好，饲料的制粒温度对其影响不大。中性甘露聚糖酶较酸性耐热性相差许多，75~80 ℃处理3~5 min相对剩余酶活保持在45.95%以上，但85 ℃处理5 min后，相对剩余酶活仅有25.48%。饲料的制粒温度对其活性影响较大，中性甘露聚糖酶的热稳定性有待进一步的提高。在中性甘露聚糖酶的基础上添加不同比例的酸性甘露聚糖酶后，其热稳定性逐步升高，酸性甘露聚糖酶比例与热稳定性呈正比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.019.T002表2甘露聚糖酶水浴法模拟制粒温度稳定性的评估项目AA7B3A5B5A3B7B对照组100.00100.00100.00100.00100.0075 ℃处理3 min94.95±5.0187.15±4.6385.12±4.0080.02±3.6778.53±2.8275 ℃处理5 min92.15±4.0284.40±5.0880.10±4.3974.43±3.0871.18±3.1080 ℃处理3 min88.40±5.1278.56±4.2372.24±3.1168.21±3.1157.09±2.0180 ℃处理5 min84.60±4.5471.98±3.2066.01±3.2355.34±2.5345.95±2.6385 ℃处理3 min82.08±3.4168.96±4.7658.52±3.0342.57±2.1932.91±1.7785 ℃处理5 min80.76±3.0466.61±2.4550.30±2.2937.95±2.1025.48±1.14%2.4甘露聚糖酶在人工猪胃消化液中的稳定性评估（见表3）由表3可知，酸性甘露聚糖酶对人工猪胃消化液具有很好的耐受性，耐受4 h后仍然有接近80%的相对剩余酶活。但是，中性甘露聚糖酶对pH值3.0的人工猪胃消化液不稳定，耐受1 h后的相对剩余酶活仅有38.14%，耐受4 h后的相对剩余酶活不足20%。中性甘露聚糖酶通过猪胃消化液时，甘露聚糖酶活性将发生巨大的不可逆的失活，且与耐受时间有一定的关系。在中性甘露聚糖酶的基础上添加不同比例的酸性甘露聚糖酶，可以提高稳定性，酸性甘露聚糖酶比例与稳定性呈正比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.019.T003表3甘露聚糖酶在人工猪胃消化液中的稳定性评估项目AA7B3A5B5A3B7B对照组100.00100.00100.00100.00100.00耐受1 h94.08±5.4587.55±4.8978.19±4.1367.32±2.4538.14±1.72耐受2 h89.09±4.1282.12±3.8264.67±3.7760.54±2.8833.56±1.82耐受3 h83.18±3.7676.61±3.7152.57±3.0945.78±2.0126.88±1.05耐受4 h78.29±3.8563.98±3.5645.26±2.9437.05±1.9316.08±1.21%2.5甘露聚糖酶在人工猪小肠消化液中的稳定性评估（见表4）由表4可知，5种配比甘露聚糖酶在人工猪小肠消化液（中性）耐受4~16 h后，相对剩余酶活均在70%以上，但也受耐受时间的影响。中性甘露聚糖酶对猪小肠消化液的稳定性优于酸性甘露聚糖酶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.019.T004表4甘露聚糖酶在人工猪小肠消化液中的稳定性评估项目AA7B3A5B5A3B7B对照组100.00100.00100.00100.00100.00耐受4 h93.27±4.1194.11±4.5196.71±4.4097.00±2.9997.43±3.67耐受8 h87.53±4.7989.25±3.6792.45±5.0192.54±4.7894.01±5.09耐受12 h80.01±3.9884.24±3.6985.23±4.7688.42±4.9888.12±4.33耐受16 h73.56±3.2878.47±3.2381.32±3.7183.04±3.0185.04±4.22%2.6甘露聚糖酶对饲料原料的酶解能力（见表5）由表5可知，5种配比甘露聚糖酶对不同的饲料原料均具有酶解效果，还原糖含量均有增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.019.T005表5甘露聚糖酶对饲料原料的酶解能力组别大米粉玉米粉豆粕麦麸米糠酒糟鱼粉小麦粉对照组100.00100.00100.00100.00100.00100.00100.00100.00A12.13±0.892.58±0.2816.78±1.4023.17±1.2544.90±2.789.20±0.813.33±1.0038.34±1.45A7B335.80±2.677.13±1.6123.56±0.9734.48±2.0968.35±4.6314.20±1.109.25±1.0745.51±2.67A5B545.63±2.4614.12±1.4857.38±3.8743.78±2.9477.30±3.7825.64±1.789.34±2.8357.32±3.76A3B737.31±1.4914.23±2.0145.93±3.7638.14±1.9877.54±4.9218.79±1.839.37±1.1345.84±2.73B22.93±1.936.99±0.1823.65±1.2432.95±1.6765.64±5.1313.19±1.078.50±1.2139.62±2.38消化液处理对照组100.00100.00100.00100.00100.00100.00100.00100.00A7.56±0.810.98±0.108.32±0.819.34±1.0119.46±1.235.67±0.341.89±0.7420.43±2.04A7B37.34±0.761.35±0.058.03±0.678.98±1.0420.56±1.655.23±0.461.99±0.7621.68±2.01A5B57.10±0.851.87±0.139.54±0.649.67±1.0923.57±1.615.34±0.502.33±0.6722.71±1.67A3B75.52±0.651.56±0.066.48±0.986.84±0.9414.87±1.074.78±0.582.02±0.6615.77±1.08B4.31±0.481.14±0.034.57±0.545.89±0.5612.39±1.063.78±0.412.00±0.425.23±0.45%酸性甘露聚糖酶对小麦粉、米糠和麦麸的水解效果最好，酶解后还原糖含量增加23.17%~44.90%；其次是豆粕和大米粉，酶解后还原糖含量增加12.13%~16.78%；但对玉米、酒糟和鱼粉的酶解效果较差，还原糖增加量不足10%。中性甘露聚糖酶对饲料原料的酶解效果优劣性与酸性一致但比酸性更佳，还原糖增加量为6.99%~65.64%。3种配比的甘露聚糖酶（A7B3、A5B5和A3B7）对饲料原料的酶解效果均优于单一甘露聚糖酶，说明二者对饲料原料的酶解具有协同作用，且按照酶活力1∶1（即5∶5）混合时，协同作用最佳，酶解效果最好，除了玉米、酒糟和鱼粉外，剩余5种原料的酶解后还原糖增加量均在40%以上。将缓冲液换成猪胃肠消化液模拟甘露聚糖酶对饲料原料的酶解效果，5种配比甘露聚糖酶对这些饲料原料均具有酶解效果，还原糖含量均有增加，但增加的量却大大减小。其中，对大米粉、玉米、豆粕、麦麸、酒糟和鱼粉酶解后的还原糖增加量均不足10%。酸性甘露聚糖酶的酶解效果要优于中性甘露聚糖酶，这与其具有良好的抗逆性，酶活损失较小有关。但二者之间的协同作用并没有因胃肠消化液对酶活的消化而消除，按照酶活力7∶3和1∶1混合时，对饲料原料酶解效果要好于其他3种配比甘露聚糖酶，以酶活力1∶1混合时最优。3讨论甘露聚糖酶的应用开发依然存在诸多问题，如能够产业化的基因较少、相关标准缺乏统一、产品质量优劣不一等[10]。本试验中，酸性甘露聚糖酶的最适pH值为3.5，在酸性环境下pH值2.5~6.0比较稳定，符合禽畜胃环境的酸碱性要求。中性甘露聚糖酶发酵酶活比较高，生产成本比较低，在中性条件下比较稳定，与张蕊等[1]和Katrolia等[2]报道一致。生产过程中的高温环境会导致饲用酶制剂不可逆转性失活。常用的评估饲用酶制剂热稳定性的方法是水浴法[11]。本试验中，高温环境使中性甘露聚糖酶饲料制粒活性呈现较大的降低，这一点也是目前中性甘露聚糖酶急需解决的问题，针对其热稳定性，进行基因工程改造以求能够达到市场需求[1,10]。动物自身能够分泌内源性蛋白酶，在水解蛋白质方面起到极为关键的效果，如胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶，而饲用酶制剂恰恰就是蛋白制品[11]。甘露聚糖酶发挥作用的前提是可以耐受胃液的酸性环境和肠液的中性环境以及能否在内源蛋白作用下保持较高活性[1,7,10-11]。本研究显示，人工猪胃消化液（pH值3.0）对中性甘露聚糖酶活性具有显著影响，酶活损失率高达80%，而对酸性甘露聚糖酶活性的影响小，可能与猪胃液具有较低的pH值和酶的来源种类不同有很大关系。近年来，对饲用木聚糖酶[12-14]、葡聚糖酶[15]、阿魏酸酯酶[16]和其他NSP[4-6]酶制剂的体外评估也得出一致的结论。大部分厂家根据各自生产的甘露聚糖酶特性检测酶活，测定条件、动物的实际情况不同。因此，需要从其他性质具体分析饲酶制剂质量，使用饲料原料作为底物才贴合饲用行业酶制剂的实际情况。该结论与肖永友[11]的观点一致。豆类植物细胞壁的主要成分为甘露聚糖，在其他植物性饲料成分中含量也很高，例如豆粕、小麦、菜籽粕和麸皮中的半乳甘露聚糖含量分别是22.7%、11.9%、19.6%和33.7%[17-18]。本试验中，添加β-甘露聚糖酶后，豆粕、小麦粉、米糠和麦麸的饲料原料释放还原糖增量最多。与单酶效果相比，β-甘露聚糖酶组合应用于不同日粮后还原糖释放量均有提高，与欧阳海燕等[14]发现的不同菌种来源NSP酶具有协同增效作用的试验结果一致。两种酶对日粮还原糖释放量的提高最明显的酶活比为1∶1，与余璐璐等[7]的研究结果一致。4结论黑曲霉来源的酸性甘露聚糖酶具有适合畜禽胃肠道pH值作用范围、热稳定性较好的优势；毛壳菌来源的中性甘露聚糖酶具有活性高、酶解效率高的优点。pH值3.0的人工猪胃消化液对中性甘露聚糖酶的活性影响极大；pH值7.15的人工猪小肠消化液对两种甘露聚糖酶的活性影响较小。两种甘露聚糖酶对饲料原料的酶解效果具有协同作用，且对模拟胃肠道环境的耐受性是一致的。将两种β-甘露聚糖酶以1∶1的酶活比例组成的复合型β-甘露聚糖酶有最佳的作用效果。