微生物发酵饲料是有效的抗生素类饲料替代品，通过益生菌对饲料原料固态发酵处理，产生富含高活性益生菌、多种酶、有机酸以及促生长因子等的优质生物饲料[1]。玉米是我国主要粮食作物之一。玉米深加工产品主要为玉米淀粉，副产物为玉米皮和玉米浸泡水，约占玉米干物质的20%，综合利用率低，造成资源浪费，加剧环境污染[2]。玉米皮中含有大量的半纤维素和纤维素以及少量的蛋白质、脂肪等[3-4]。直接将玉米皮用作饲料饲喂动物适口性比较差，难以被动物消化吸收。玉米浆是含约40%干物质的浓缩玉米浸泡水[5]，含有蛋白质、多糖、氨基酸、维生素和微量元素等营养成分[6]。目前，玉米浸泡水一部分用来制作喷浆饲料，一部分直接排放至污水处理厂，产品附加值低[7-8]。黑曲霉菌渣和石膏是发酵柠檬酸产生的工业废渣。黑曲霉菌渣中含有壳聚糖、蛋白质、脂肪、微量元素和多种细胞内酶等营养物质[9]。石膏可作为钙源被动物利用。目前，菌渣和石膏大多被廉价出售或随处堆放处理，未充分利用其价值。因此，利用玉米皮、玉米浆、黑曲霉菌渣和石膏等玉米深加工副产物作为饲料原料生产绿色、营养、经济的生物饲料对饲料行业和玉米深加工企业具有重要意义。课题组前期的研究工作主要利用玉米皮为原料生产发酵饲料[10]。在此基础上，本试验以玉米皮和玉米浆为主要原料，黑曲霉菌渣和石膏为辅料，采用酿酒酵母、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌作为发酵菌株进行混菌培养生产生物饲料。在单因素试验的基础上，通过4因素3水平的正交试验优化固态发酵玉米皮饲料的工艺条件。研究拓展了玉米淀粉加工和发酵柠檬酸的副产物综合利用的新途径，为玉米深加工废弃资源的综合利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌种酿酒酵母（108 CFU/mL）、植物乳杆菌（109 CFU/mL）、干酪乳杆菌（109 CFU/mL）、枯草芽孢杆菌（108 CFU/mL）和地衣芽孢杆菌（108 CFU/mL）保藏于本实验室。1.1.2试验原料和辅料玉米皮、玉米浆、淀粉乳、黑曲霉菌渣和石膏由吉林中粮生化有限公司提供。1.1.3培养基酿酒酵母种子培养基：40 g/L淀粉乳液化，糖化，加入5 g/L玉米浆，pH值6.5。乳酸菌种子培养基：40 g/L淀粉乳液化，糖化，加入15 g/L玉米浆、5 g/L酵母浸粉，pH值6.5。芽孢杆菌种子培养基：40 g/L淀粉乳液化，糖化，加入5 g/L玉米浆、2 g/L酵母浸粉，pH值6.5。1.2试验方法1.2.1菌种活化酵母菌：取-80 ℃保存的酿酒酵母菌种，融化，按2%接种量接种于YPD培养基，30 ℃、200 r/min摇床振荡培养12 h；乳酸菌：取-80 ℃保存的乳酸菌混合菌株（植物乳杆菌∶干酪乳杆菌混合菌株=1∶1），融化，按2%接种量接种于MRS培养基，30 ℃、200 r/min摇床振荡培养12 h；芽孢杆菌：取-80 ℃保存的芽孢杆菌混合菌（枯草芽孢杆菌∶地衣芽孢杆菌=1∶1），按2%接种量接种于LB培养基，37 ℃、200 r/min摇床振荡培养12 h。1.2.2种子培养将活化后的菌株按2%的接种量分别接入对应的种子培养基中，依照各菌活化时的温度和转速培养18 h，将培养液混合，混合后种子培养基总活菌数为3×108 CFU/mL。1.2.3固态发酵培养将玉米浆装入三角瓶中，加入0.9%黑曲霉菌渣和1.4%石膏（以总重计），121 ℃灭菌20 min，加入种子培养液，酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌活菌数比例1∶1∶1，接种量为固态发酵培养基的20%（体积质量比）。与灭菌后的玉米皮混合（玉米皮∶玉米浆=5∶4），搅拌均匀，装入三角烧瓶后用带有单向阀封口膜封口，室温下静置培养5 d。1.2.4益生菌相互作用分析采用滤纸片法，取1种菌液均匀涂布在平板培养基上，在培养基表面放置3个直径为6 mm灭菌的圆形滤纸片，取其他的菌液滴加在滤纸片上，培养后观察滤纸片周围现象。1.2.5玉米皮固态发酵工艺优化单因素试验采用单因素试验，分别考察装料量、初始pH值、含水量和接种量对玉米皮固态培养后活菌数、粗蛋白含量和pH值指标的影响，确定单因素试验最佳水平。1.2.6正交试验设计在单因素试验的基础上，以装料量（A）、初始pH值（B）、含水量（C）和接种量（D）为考察因素，以发酵后总活菌数、粗蛋白增长率和pH值变化值为指标，设计4因素3水平L9（34）的正交优化试验，以确定固态发酵玉米皮生产饲料的工艺条件。玉米皮固态发酵条件优化正交试验因素与水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.T001表1玉米皮固态发酵条件优化正交试验因素与水平水平A装料量/%B初始pH值C含水量/%D接种量/%1705.24582805.550103905.855121.3测定指标及方法粗蛋白（CP）含量测定参照GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定》中的凯氏定氮法；活菌数（viable count）测定采用平板计数法[11]：涂布时添加微生物抑制剂，对酿酒酵母计数用50 mg/L青霉素作为稀释液，在YPD固体培养基上涂布；对乳酸菌计数使用50 mg/L那他霉素作为稀释液，在MRS固体培养基上涂布；对芽孢杆菌计数在LB固体培养基上涂布；水分（MSTR）测定按照GB/T 6435—2014《饲料中水分的测定》；pH值使用酸度计测定。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 25.0 进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan's法进行多组样本间差异显著性分析。2结果与分析2.1益生菌间的作用关系（见表2）乳酸菌产生的有机酸和胞外细菌素能够抑制环境中的微生物，在食品保存和安全方面显示出重要的抗菌特性[12]。芽孢杆菌可分泌多种高活性的抑菌物质，如裂解酶、枯草菌素、脂肽和聚酮化合物等[13-14]。若组合适当，多菌混合培养获得的活菌数比单独培养显著提高[15]。考察菌株间互作关系以确定益生菌混合培养的可行性。在平板上可观察到3种不同现象：滤纸片周围有明显的透明圈，表明益生菌之间有拮抗作用；滤纸片周围有菌体大量生长，表明滤纸片上的益生菌占生长优势，并且菌株之间有促进作用；滤纸片周围既无透明圈也无菌体生长，表明菌株之间无拮抗作用。由表2可知，酿酒酵母较其他益生菌占生长优势，对其他菌无拮抗作用；枯草芽孢杆菌对地衣芽孢杆菌和干酪乳杆菌有轻微的抑制作用，对酿酒酵母和植物乳杆菌无拮抗作用；地衣芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌有协同作用，对酿酒酵母和干酪乳杆菌有轻微的抑制作用，对植物乳杆菌无拮抗作用；植物乳杆菌对干酪乳杆菌有抑制作用，对酿酒酵母拮抗作用较明显，对枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌无拮抗作用；干酪乳杆菌与枯草芽孢杆菌有协同作用，对酿酒酵母和地衣芽孢杆菌有轻微抑制作用，对植物乳杆菌无拮抗作用。结果表明，这5株益生菌之间抑制程度较小，可以进行混合培养。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.T002表2益生菌间的作用关系菌种生长或抑菌圈酿酒酵母枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌植物乳杆菌干酪乳杆菌酿酒酵母生长圈×0.69±0.010.78±0.020.79±0.010.78±0.02抑菌圈×————枯草芽孢杆菌生长圈—×———抑菌圈—×0.65±0.02—0.69±0.01地衣芽孢杆菌生长圈—0.72±0.02×——抑菌圈0.68±0.01-×—0.69±0.01植物乳杆菌生长圈—0.72±0.020.70±0.02×—抑菌圈0.80±0.01——×0.73±0.02干酪乳杆菌生长圈—0.70±0.01——×抑菌圈0.76±0.01—0.65±0.01—×注：“×”表示未进行试验；“—”表示无拮抗作用。cm2.2单因素试验2.2.1装料量对饲料发酵的影响（见图1）试验菌种既有好氧菌，也有兼性厌氧菌。理论上讲，前期好氧菌生长，消耗一定氧气后有利兼性厌氧菌生长。选用的方式为静置培养，因此装料量对固态发酵氧气供应、热量传递和物质交换有很大的影响。在初始pH值5.0、含水量50%、接种量20%条件下考察不同装料量对发酵饲料的影响。由图1可知，在不同装料量下，乳酸菌生长最好，其次是酵母菌，芽孢杆菌活菌数较少，可能因为玉米浆中某些成分对其生长产生抑制。随着装料量的增加，总活菌数先上升后下降。当装料量为60%时，活菌数最高，为3.2×109 CFU/g；此时，乳酸菌数为2.7×109 CFU/g，占总活菌数的85%。当装料量为40%时，氧气含量较充足，此时酵母菌数最高，为3.4×108 CFU/g。随着装料量的增加，粗蛋白含量逐渐下降。当装料量为40%时，粗蛋白含量最高，为20.1%，比发酵前提高8.3%，显著高于其他组（P0.05）。在发酵过程中水分不易蒸发，不同装料量发酵后含水量几乎无变化。当装料量为60%时，pH值为6.5，无发酵酸香味；装料量为80%时，pH值为5.0，具有醇香和淡酸味。在酸性条件下的发酵饲料适口性强、不易染菌、耐贮藏，且此时总活菌数仍超过109 CFU/g。因此，综合选择装料量为80%。图1装料量对饲料发酵的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F1a1（a）活菌数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F1a2（b）粗蛋白含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F1a3（c）pH值和含水量2.2.2初始pH值对饲料发酵的影响（见图2）pH值可以通过影响菌体细胞上的电荷分布进而影响膜蛋白功能，改变菌体对营养物质吸收状况，最终影响菌体自身生长以及代谢产物的积累[16]。因此，选择适宜的pH值环境利于微生物的生长代谢。在装料量80%、含水量50%、接种量20%条件下考察初始pH值对发酵饲料的影响。饲料原料混合后pH值为3.8~3.9，该pH值条件下菌体很难生长。将pH值调至中性需要加大量碱，会使玉米浆中蛋白变性，出现大量絮状沉淀，为在实际生产时减少操作成本，将pH范围设置为4.0~5.5。由图2可知，初始pH值为4.0~4.5时菌体生长速度慢，总菌数较低；初始pH值大于4.5，总菌数快速增加。当初始pH值为5.5时，总活菌数、乳酸菌数和酿酒酵母数达到最大值，分别为1.5×109、1.2×109 CFU/g和2.9×108 CFU/g；发酵后粗蛋白含量明显高于发酵前，pH值降低最多，含水量为49.3%。因此，应在发酵前将原料初始pH值调为5.5。图2初始pH值对饲料发酵的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F2a1（a）活菌数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F2a2（b）粗蛋白含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F2a3（c）pH值和含水量2.2.3含水量对饲料发酵的影响（见图3）含水量过低会影响培养基质中营养物质的传输，限制微生物自然生长；含水量过高会使底物结块，导致基质内部透气性降低而难以均匀发酵[17]。在装料量80%、初始pH值5.5、接种量20%条件下考察不同含水量对发酵饲料的影响。饲料原料混合后接入种子液，不另添加水时含水量为40%。过高的水分会增加饲料染菌概率，且干燥过程增加大量能耗，因此设置含水量最高为55%。由图3可知，含水量为40%~45%时活菌数无显著差异（P0.05），菌体生长较差；随着含水量的增加，活菌数不断增加，说明在一定范围内，培养基质中水分越高，菌株生长越好。含水量为50%~55%时，3种发酵菌株生长较好。含水量为55%，活菌数达到最大值，为7.0×109 CFU/g。粗蛋白含量也随含水量增加而逐渐增大。在含水量为55%时，粗蛋白含量为21.1%，发酵后粗蛋白含量较发酵前增加9.0%。此时，pH值降为4.9，含水量为54.2%。综合考虑，选择初始含水量为55%。图3含水量对饲料发酵的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F3a1（a）活菌数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F3a2（b）粗蛋白含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F3a3（c）pH值和含水量2.2.4接种量对饲料发酵的影响（见图4）接种量太多会造成在发酵初期菌体生长过快，消耗大量的营养；接种量太少，会导致发酵周期延长。在装料量80%、初始pH值5.5、含水量55%条件下，考察不同接种量对发酵饲料的影响。由图4可知，随着接种量的增加，发酵后的总活菌数随之增加。当接种量为20%时，活菌数最高，达到9.9×109 CFU/g，与接种量10%无显著差异（P0.05）；粗蛋白含量最高，为21.4%，发酵后粗蛋白增加明显。但是，粗蛋白增加量和pH值与接种量10%时无显著差异（P0.05）。在考虑实际生产成本和利润情况下，选取接种量为10.0%，此时粗蛋白含量为21.0%，比发酵前增长9.6%，pH值为5.0，含水量为54.3%。图4接种量对饲料发酵的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F4a1（a）活菌数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F4a2（b）粗蛋白含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F4a3（c）pH值和含水量2.3正交试验结果（见表3~表5）通过单因素试验得出固态发酵玉米皮的工艺条件为装料量80%、初始pH值5.5、含水量55%、接种量10%。在此基础上，以活菌数、粗蛋白增长率和pH值变化值为指标，设计L9（34）正交试验，试验结果及极差分析见表3，方差分析见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.T003表3L9（34）正交试验结果项目ABCD总菌数/(×108 CFU/g)粗蛋白含量增长率/%pH值变化值111111.03.5-0.122122234.010.40.0931333100.115.0-0.42421232.07.3-0.065223195.28.40.36623120.76.6-0.237313241.45.7-0.17832130.94.6-0.189332148.913.40.15总菌数K1135.1044.422.60145.10K297.92130.1084.9276.10K391.20149.70236.70103.02R14.6335.0978.0323.00因素主次CBDA较优水平A1B3C3D1粗蛋白量增长率K128.9016.4414.6525.25K222.2123.3531.0722.63K323.6935.0129.0726.92R2.236.195.471.43因素主次BCAD较优水平A1B3C2D3pH值变化值K1-0.44-0.35-0.530.39K20.070.270.18-0.31K3-0.21-0.50-0.23-0.66R0.170.260.230.35因素主次DBCA较优水平A1B3C1D310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.T004表4正交试验结果方差分析源Ⅲ类平方和自由度均方F值P值总菌数A745.4942372.74720.2460B4 179.80022 089.900113.5150C18 803.68029 401.840510.6710D1 612.5362806.26843.7930误差165.697918.411总计48 866.89817粗蛋白增长率A16.45828.22915.8200.001B117.575258.788113.0130C107.009253.504102.8570D6.23323.1125.9820.022误差4.6829总计1 495.10717pH变化值A0.08520.0435.7530.025B0.21820.10914.7350.001C0.16520.08211.1270.004D0.37420.18725.2800误差0.06790.007总计0.98317由表3可知，4个因素对总活菌数的影响程度依次为含水量初始pH值接种量装料量；对粗蛋白含量增长率的影响程度依次为初始pH值含水量装料量接种量；对pH值的影响程度依次为接种量初始pH值含水量装料量。由表4可知，4个因素对玉米皮固态发酵的总活菌数、粗蛋白含量和pH值变化值的影响均达到显著水平（P0.05）。3个指标单独分析出的优化条件不一致，需要根据因素的影响主次综合考虑，确定最佳条件。因素C对总菌数影响最大，取C3为最优；因素B对粗蛋白增长率影响最大，取B3为最优；因素D对pH变化值影响最大，取D3为最优；因素A对3个指标的影响均较小，并且3个指标最优水平均是A1。因此，益生菌混合固态发酵玉米皮最佳的试验组合为A1B3C3D3，即装料量70%、初始pH值5.8、含水量55%、接种量12%。对A1B3C3D3这组发酵条件的结果进行验证。由表5可知，发酵后活菌数9.6×109 CFU/g；粗蛋白含量为21.2%，较发酵前增长14.3%；pH值为4.8，比发酵前降低0.58。该结果与正交试验中的活菌数、粗蛋白含量和pH值相近，表明益生菌固态发酵玉米深加工副产物生产生物饲料工艺单因素与正交优化试验结果可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.T005表5验证试验结果发酵条件活菌数/（×108 CFU/g）粗蛋白含量/%pH值A1B3C3D396.321.24.82.4单菌和混菌固态培养微生物生长情况的比较（见图5、表6）由图5可知，各菌在单菌培养和混菌培养时的生长趋势一致，但混菌培养时的活菌数明显高于单菌培养，说明混合培养对菌体生长有显著的促进作用。酵母菌在0~1 d增长缓慢，第5 d活菌数达到最大值，混菌培养比单菌培养增加10%；乳酸菌在0~3 d时增长缓慢，3~5 d增长迅速，7~10 d逐渐达到稳定期；培养7 d，混菌培养的乳酸菌活菌数比单菌培养提高18倍；芽孢杆菌在0~3 d为对数生长期，第3 d达到最大值。图5单菌和混菌固态培养下微生物生长曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F5a1（a）酵母菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F5a2（b）乳酸菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F5a3（c）芽孢杆菌对微生物对数生长期的lnX-T进行回归分析，得到μmax，倍增所需时间为td=ln2/μmax。由表6可知，混菌固态培养时每种菌的最大比生长速率均高于单菌培养，倍增时间缩短。混菌固态培养时乳酸菌的最大比生长速率是单菌培养的2.8倍。在混菌培养时，混合菌种中的酵母菌和芽孢杆菌是好氧菌，生长消耗氧气后更有利于乳酸菌生长。以上结果均表明混菌固态培养要优于单菌培养。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.T006表6单菌和混菌培养下微生物生长参数参数酵母菌乳酸菌芽孢杆菌单菌培养混菌培养单菌培养混菌培养单菌培养混菌培养μmax/d-1（R2）1.205（0.996）1.762（0.818）1.209（0.986）3.407（0.973）0.352（0.996）0.497（0.818）td/d0.5750.3930.5730.2031.9691.3952.5玉米皮扫描电镜图（见图6）由图6可知，发酵前的玉米皮表面平整、结构非常致密；固态发酵5 d，玉米皮的表面结构变得粗糙，表面具有许多明显的孔洞，表明木质素、纤维素和半纤维素之间的致密结构已经有一定程度的破坏，表明通过混合益生菌发酵后的玉米皮会更有利于动物吸收利用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.20.012.F006图6玉米皮扫描电镜图（400×）3讨论近年来，微生物发酵饲料趋向多种混合菌种进行固态发酵，最常用的发酵菌种有酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌和部分霉菌等。研究者们使用不同的菌种组合对不同原料的发酵工艺进行研究，目的是改善饲料原料的适口性使其易被消化以及提高营养价值。使用产朊假丝酵母、啤酒酵母和白地霉固态发酵玉米皮，优化后真蛋白是发酵前的1.94倍[18]。采用黑曲霉和酿酒酵母混合固态发酵玉米皮，每克益生活菌总数超百亿[10]。本研究中，经过5 d发酵，饲料的pH值从5.5降低到4.8，呈酸香味，适口性得到改善；玉米皮的表面结构变得粗糙疏松，有利于消化；粗蛋白达20%。混菌培养时各菌的最大比生长速率较单菌培养显著增加，倍增时间缩短，5 d时活菌数接近1010 CFU/g。4结论通过正交试验优化固态培养的工艺条件为装料量70%、初始pH值为5.5、含水量55%、接种量12%，该条件下玉米皮发酵饲料中活菌数为9.6×109 CFU/g、粗蛋白含量为21.2%、pH值4.8，达到了作为生物发酵饲料的要求。