牦牛是青藏高原特有的、不可替代的畜种[1-2]。泌乳期牦牛需要良好的营养支撑，以保障产奶量和牛奶质量。延长牦牛泌乳高峰期的天数对提高牦牛整个泌乳期的产奶量、维持其较高的繁殖性能和生产性能、保障哺乳期子代机体的正常生长发育和免疫调节极其重要[3]。受青藏高原牧草季节性盈亏及饲养水平良莠不齐的限制，牦牛泌乳期营养物质摄入量无法得到满足[4-5]。因此，本试验探究不同饲喂水平对泌乳期牦牛生产性能、瘤胃发酵和血清生化指标的影响，为泌乳期牦牛的合理饲养提供参考。1材料与方法1.1试验设计选取胎次相同、产犊日期相近、体重（230±30）kg的大通母牦牛15头，随机分为3组，每组5个重复，即自由采食组（AL组）、80%采食组（IR80组）和60%采食组（IR60组）。试验期150 d。试验牦牛饲养于青海省大通种牛场，采用梯度饲喂，精、粗分开（先精后粗）的饲喂方式，试验日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.003.T001表1试验日粮组成及营养水平（绝干基础）项目泌乳前期（30~70 d）泌乳后期（71~150 d）原料组成/%燕麦青干草74.0672.37玉米14.7815.75小麦2.592.76小麦麸1.821.93菜籽油0.260.28豆粕3.373.59菜粕1.821.93食盐0.260.28预混料1.041.11合计100.00100.00营养水平总能/(MJ/kg)15.6716.28代谢能/(MJ/kg)8.428.08干物质/%94.1694.64有机物质/%91.1492.58粗蛋白质/%8.688.32粗脂肪/%2.982.26中性洗涤纤维/%47.7156.65酸性洗涤纤维/%20.6325.53钙/%0.890.89磷/%0.670.67注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 3 000 IU、VD3 300 IU、VE 50 IU、烟酸50 mg、铁48 mg、铜12 mg、锰20 mg、锌20 mg、硒0.3 mg。2.营养水平均为实测值。1.2饲养管理试验期间母牛单栏饲养，每日分早、晚两次饲喂，保证自由采食组母牛饲槽内有剩余草量，限饲组饲喂量根据前1 d自由采食组采食量计算而定。犊牛与母牛隔离饲养，每日早晚将犊牛放回母牛圈舍哺乳，哺乳后将犊牛赶回犊牛圈舍，饲喂犊牛等量苜蓿干草，犊牛、母牛均自由饮水。1.3样品采集在泌乳第65 d和120 d，每组选取3头健康牦牛，早晨对每头牦牛进行连续两天的空腹称重，记录相应数据。使用真空采血管从牦牛颈静脉采血5 mL，在离心机中4 000 r/min离心10 min，取上层血清于冻存管中，使用瘤胃液采集管抽取牦牛瘤胃液样品于冻存管中，将采集的血清和瘤胃液样品保存于超低温冰箱，待测。1.4测定指标及方法1.4.1生产性能记录牦牛初重、65 d体重、120 d体重和牦牛采食量，计算牦牛平均干物质采食量、平均日增重。平均日增重=(120 d体重-初重)/120(1)平均日采食量=120 d总采食量/120(2)1.4.2瘤胃发酵参数1.4.2.1pH值采用HANNA HI221型台式酸度计测定pH值。1.4.2.2氨态氮（NH3-N）含量参照冯宗慈等[6]改进的比色法测定，测定仪器为岛津UV-1700紫外可见分光光度计，在波长625 nm处测定溶液吸光值，利用标准曲线求出待测样品的NH3-N含量。本试验NH3-N的标准曲线拟合公式为y=31.66 5x-00.05 3（R2=0.999 5，n=6）。其中：y为NH3-N含量，单位mg/L；x为吸光值。1.4.2.3挥发性脂肪酸（VFA）含量参考相关文献[7]，VFA含量采用气相色谱仪（日本岛津GC-2014）测定，仪器参数为FID检测器温度250 ℃，色谱柱型号为AT-FFAP毛细管填充柱（30.0 m×0.32 μm）。柱温箱程序升温：初始温度90 ℃，保持1 min；以10 ℃/min升至120 ℃，保持1 min；以10 ℃/min 升至150 ℃，保持3 min。汽化温度250 ℃，进样量使用为自动进样器，横流模式，载气为高纯度氮气（99.99%）压力0.4 MPa，检测器氢气压力为0.3 MPa，空气压力为0.42 MPa，毛细管柱压力为0.6 ~0.8 MPa，分流比为40∶1。1.4.3血清指标1.4.3.1血清生化指标血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、尿素氮（BUN）、葡萄糖（GLU）、总胆固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）、钙（Ca）等含量送至青海省人民医院检测。1.4.3.2血清激素指标采用ELISA酶联免疫试剂盒测定促卵泡激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、黄体酮（P4）和催乳素（PRL）的含量，试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司。1.4.4乳产量及营养成分利用差值法间接测定泌乳量，具体方法为早、晚各称量1次犊牛哺乳前后体重，以此求得母牛乳产量。试验期间（泌乳50 d~泌乳150 d），每两周测定1次乳产量。分别在泌乳前期和后期采集每头牦牛乳样，-20 ℃保存，待测。在实验室常温下解冻测样，乳氮含量采用凯氏定氮法测定；乳脂肪采用食品中脂肪的测定方法测定（GB 5009.6—2016）。1.5数据统计与分析采用Excel对数据进行初步整理，采用SPSS 20.0软件进行数据独立性、正态性和方差齐性检验，采用ANOVA进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1饲喂水平对泌乳期牦牛生产性能的影响（见表2、图1）由表2可知，随着泌乳天数的增加，牦牛平均日采食量波动较小。饲喂水平对泌乳期牦牛日增重、泌乳后期乳产量和泌乳前期乳蛋白含量影响显著（P0.05），且均随采食量的降低而降低。在泌乳前期，IR60组母牛平均日增重显著低于其他组（P0.05）。在泌乳后期，IR60组母牛平均日增重显著高于泌乳前期（P0.05）。泌乳120 d时，IR80组和IR60组牦牛乳产量均显著低于AL组（P0.05）。整个泌乳期乳脂含量较为恒定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.003.T002表2饲喂水平对泌乳期牦牛生产性能的影响项目泌乳期AL组IR80组IR60组初重/kg235.87±31.46B236.30±27.15235.37±28.6765 d体重/kg273.29±29.35ABa268.20±31.83ab240.49±26.52b120 d体重/kg308.61±33.17Aa293.28±30.44a254.24±28.93b平均干物质采食量/(kg/d)前期7.32±0.51a5.95±0.06b4.49±0.01Ac后期7.41±0.30a5.78±0.23b4.37±0.01Bc平均日增重/(g/d)前期479.84±173.90a489.25±121.06a64.52±37.25Bb后期630.68±188.67a583.33±125.17a250.00±131.05Ab乳产量/(kg/d)前期3.08±0.373.34±0.35A2.77±0.38A后期2.93±0.13a2.45±0.20Bb2.05±0.31Bb乳蛋白/%前期5.84±0.46a5.76±0.39a4.81±0.42b后期5.44±0.705.60±0.124.88±0.34乳脂肪/%前期4.52±1.494.23±0.324.27±0.68后期6.03±1.895.33±1.144.42±0.31注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），同列数据肩标大写字母不同表示差异显著（P0.05），无字母或相同字母表示差异不显著（P＞0.05）；下表同。由图1可知，由于饲喂水平不同，IR80组和IR60组牦牛乳产量受到抑制。自由采食组与限饲组牦牛乳产量差异随泌乳天数的增加不断扩大，牦牛泌乳量峰值出现在泌乳期第70~90 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.003.F001图1饲喂水平对泌乳期牦牛乳产量的影响2.2饲喂水平对泌乳期牦牛瘤胃发酵参数的影响（见表3）由表3可知，泌乳前期IR80组瘤胃液氨态氮含量低于AL组（P0.05），氨态氮含量随饲喂水平的降低有升高的趋势。总挥发性脂肪酸和乙酸含量随饲喂水平的降低而降低；泌乳后期，牦牛瘤胃丙酸和丁酸含量随饲喂水平降低显著降低（P0.05）。随泌乳天数的增加，AL组丁酸含量、IR80组氨态氮含量、IR60组丁酸含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.003.T003表3饲喂水平对泌乳期牦牛瘤胃发酵参数的影响项目泌乳期AL组IR80组IR60组pH值前期6.85±0.226.94±0.406.98±0.10后期6.89±0.126.96±0.707.02±0.20氨态氮/(g/L)前期2.64±0.51b2.27±0.35Bb3.45±0.78a后期2.93±0.46c3.53±0.44Ab4.22±0.61a乙酸/(mmoL/L)前期51.00±3.69a43.83±7.91b46.68±2.98b后期57.30±5.46a51.85±6.73b47.85±4.87b丙酸/(mmoL/L)前期9.70±0.558.97±1.788.99±0.59后期10.59±1.03a9.81±1.38a8.81±0.58b丁酸/(mmoL/L)前期5.99±1.51B6.14±1.845.77±0.25B后期8.73±1.08Aa7.16±1.06b6.38±0.45Ac总挥发性脂肪酸/(mmoL/L)前期68.13±5.76a60.50±11.64b63.15±3.80ab后期78.66±7.67a70.97±9.19b65.14±5.94b2.3饲喂水平对泌乳期牦牛血清生化指标的影响（见表4）由表4可知，在泌乳前期，AL组谷丙转氨酶活性显著高于其他组（P0.05）；3个试验组牦牛泌乳前期尿素氮含量显著低于泌乳后期（P0.05），IR80组牦牛尿素氮含量最低。IR80组牦牛总蛋白含量最高，且泌乳前期显著低于泌乳后期（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.003.T004表4饲喂水平对泌乳期牦牛血清生化指标的影响项目泌乳期AL组IR80组IR60组葡萄糖/(mmol/L)前期4.51±0.444.52±0.394.54±0.19后期4.77±0.194.95±0.504.44±0.18总蛋白/(g/L)前期71.60±5.2973.25±3.32B72.78±4.01后期76.00±3.5081.23±1.89A74.38±6.89白蛋白/(g/L)前期30.73±2.2930.25±1.2031.87±2.50后期32.73±2.9034.77±4.1534.25±2.12球蛋白/(g/L)前期40.87±4.9043.00±2.1240.93±4.04后期43.27±5.2346.47±2.4640.13±6.47尿素氮/(mmol/L)前期2.80±0.27B1.79±0.02B1.98±0.64B后期3.77±0.58A2.83±0.35A4.13±1.06A谷丙转氨酶/(U/L)前期44.67±4.16a27.50±0.71b33.25±2.63b后期47.00±1.0037.67±8.0238.75±3.77谷草转氨酶/(U/L)前期98.67±23.1678.00±9.9076.25±13.12后期96.33±19.22114.33±23.5391.25±21.30总胆固醇/(mmol/L)前期3.03±0.753.01±0.112.64±0.81后期2.51±0.243.42±0.422.83±0.64甘油三酯/(mmol/L)前期0.13±0.040.09±0.010.09±0.02后期0.08±0.030.13±0.040.10±0.04钙/(mmol/L)前期2.10±0.112.14±0.052.23±0.11后期2.21±0.202.40±0.152.27±0.11碱性磷酸酶/(U/L)前期157.00±55.57129.50±10.61107.75±43.29后期152.67±60.70145.33±2.08106.50±42.572.4饲喂水平对泌乳期牦牛血清生殖激素含量的影响（见表5）由表5可知，IR60组牦牛生殖激素均处于较高水平，其中65 d催乳素含量和120 d雌二醇含量显著高于其他组（P0.05）。AL组和IR80组牦牛血清中黄体酮含量泌乳后期显著高于泌乳前期（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.003.T005表5饲喂水平对泌乳期牦牛血清生殖激素含量的影响项目泌乳期AL组IR80组IR60组促卵泡激素/(μg/L)前期———后期3.98±0.183.78±0.214.15±0.71促黄体生成/(ng/L)前期———后期52.16±8.2155.73±7.9162.83±13.29雌二醇/(pmol/L)前期108.84±29.10103.04±4.05143.44±33.28后期103.00±16.59b99.98±3.29b143.29±10.33a黄体酮/(nmol/L)前期1.26±0.23B1.59±0.18B2.11±0.74后期2.40±0.17A2.28±0.35A2.59±0.14催乳素/(ng/L)前期182.15±23.60b155.92±14.62b241.32±33.87a后期197.68±10.61177.95±27.98242.23±37.143讨论3.1饲喂水平对泌乳期牦牛生产性能的影响泌乳期动物采食量是影响生产性能的重要因素之一。楼璨[8]研究表明，饲喂水平对泌乳期绵羊乳产量及乳中蛋白含量影响差异显著，与本研究结果一致。AL组牦牛乳产量为2.93~3.08 kg/d，低于Akbar[9]得出的3.3 kg/d的结果，可能是因为本试验饲喂燕麦青干草为主的纤维素丰富的日粮，虽然在自由采食的情况下，能量摄入量仍低于Akbar的试验水平，导致乳产量偏低。金鑫燕等[10]研究发现，牦牛乳蛋白含量为3.60%~4.20%，低于本试验AL组测得的5.44%~5.84%。本试验自由采食的情况下，淀粉摄入量较前者高，使瘤胃丙酸含量增多，有利于氮的利用和乳蛋白的形成。3.2饲喂水平对泌乳期牦牛瘤胃发酵参数的影响瘤胃氨态氮含量反映瘤胃微生物分解含氮物质产生氨态氮的速度及其对氨态氮的摄取利用情况[11]。Murphy等[12]报道，微生物生长的最佳氨态氮含量为6.3~27.5 mg/dL。牦牛氨态氮含量为3.9~16.5 mg/dL[13]，本试验结果略低于此数值，可能因为泌乳期氮代谢速率提高且日粮氮水平低。本试验中，牦牛瘤胃氨态氮含量随饲喂水平的降低而升高，表明氮的利用效率较高。瘤胃挥发性脂肪酸与反刍动物瘤胃营养及瘤胃微生物关系密切[14]。泌乳期牦牛瘤胃总挥发性脂肪酸含量为60.50~78.66 mmoL/L。谢敖云等[15]研究表明，生长期牦牛瘤胃总挥发性脂肪酸含量为34.24~40.82 mmoL/L。碳水化合物摄入量是影响挥发性脂肪酸产量的主要因素[16]，泌乳期牦牛采食量较大导致总挥发性脂肪酸含量升高。3.3饲喂水平对泌乳期血清生化指标的影响GLU和TG反应机体能量代谢与脂代谢情况。本研究中，血清GLU和TG含量不受饲喂水平的影响，表明IR60组日粮能够满足机体糖代谢。血清中TP含量反应蛋白质合成分解速率，血清中BUN含量受日粮中含氮化合物降解速率、氨的合成速率及瘤胃微生物利用氨速率的共同影响[17]。雷蕾等[18]、张志飞等[19]和李春生[20]研究表明，牦牛血清中TP和BUN的含量分别为60.71~68.97 g/L、5.94~8.56 mmol/L。本试验中，血清中TP含量较高，BUN含量较低。郑喜邦[21]研究发现，黑白花奶牛泌乳期血清BUN含量降低，可能因为泌乳期乳腺活动增强，氮消化率和代谢率加强，使得TP和BUN含量发生变化。适宜的ALT和AST活性能够促进蛋白质的合成。自由采食组牦牛泌乳前期ALT活性较高，其乳蛋白含量高于限饲组。3.4饲喂水平对泌乳期血清生殖激素含量的影响PRL能够促进牛乳腺生长发育，发动和维持泌乳[22]。Smith等[23]研究发现，E2参与泌乳启动，临近分娩时，血清E2的含量增加明显，会刺激脑垂体释放大量PRL，启动泌乳。P4可以使母体维持妊娠状态，促进乳腺导管的发育，抑制分娩与泌乳的开始。一旦泌乳开始，黄体酮对产奶量不再产生影响[24]。本试验中，IR60组牦牛PRL和E2含量均高于其他两组，可能因为IR60组牦牛乳产量较低，大量的PRL和E2会刺激乳腺发育泌乳。江青东[25]研究表明，大鼠在整个妊娠期，P4处于较低水平，泌乳期18 d时达到最低。本试验牦牛泌乳前期，P4含量保持较低水平，两者结果一致，到泌乳后期P4含量上升。受饲喂水平的影响，IR60组牦牛E2含量过高，会刺激催乳素的产生。4结论泌乳期牦牛需供给高营养水平的日粮以保证牦牛良好的瘤胃代谢、激素代谢水平及较高的生产性能。