黄芪为豆科多年生草本中药材,其成分主要包含生物碱、多糖、三萜皂苷类、葡萄糖醛酸和黄酮类等生物活性物质。其中,黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)的含量最多,免疫活性最强[1-3]。APS兼具营养性和药物性,可以增强动物免疫系统,促进抗体产生,是优良的免疫辅助剂[4-5]。1APS的提取、组成及结构特征目前,有多种提取APS的方法,包括水提醇沉法、微波提取法、碱浸提法、酶提取法、超滤法和超声波提取法等[6-7],工业上常使用水提法[8]。杜国丰等[7]使用水提醇沉法提取APS,发现在提取时间2.5 h、温度90 ℃、料液比1∶8时,APS的提取效率较高。研究发现,利用超声波辅助提取法结合响应面法优化,APS的提取率较优[9]。APS是从黄芪根部分离出来结构复杂的、易溶于水的中性杂多糖,呈棕黄色粉末状,由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等多种不同的单糖组成[1,3,10]。其中,单糖包括葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖醛酸和岩藻糖,相对分子质量约9 000~60 000[7,11-12]。APS可以分为平均分子量超过500 kDa的大分子组分(APS-Ⅰ)和平均分子量为10 kDa的小分子组分(APS-Ⅱ)。单糖组成分析显示,APS-Ⅰ由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸组成,比例约为1.5∶1.0∶5.4∶0.08∶0.1;APS-Ⅱ中葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸的摩尔比为9∶1∶1.4∶0.04∶0.001[13]。外观、性状、质量较优的APS产品中总多糖含量为60.0%~75.0%,葡萄糖和阿拉伯糖的峰面积比值为5.28~5.71[14]。不同种属和不同栽培方式的黄芪,其多糖片段分子量分布范围不同[15]。APS-Ⅰ呈丝带状结构,表面圆滑工整,单糖间的连接方式以α-糖苷键为主;APS-Ⅱ表面呈不规则纤维丝状堆积,单糖间连接方式包含α-糖苷键与β-糖苷键[16-17]。2黄芪多糖效应机制及对水产动物的免疫影响APS可以刺激免疫分子、免疫细胞及免疫器官,具有提高动物抗氧化活性、调控炎症反应、维持细胞稳态、增强免疫器官和免疫组织功能以及抗病等作用[18-21]。2.1增强抗氧化能力植物多糖可以通过提高机体抗氧化能力来实现其药用作用[22]。APS能够提高氧化应激酶的活性,减轻衰老和疲劳所引起的氧化应激[23]。在高糖条件下,APS下调Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)信号通路反应,减少细胞内活性氧簇生成和氧化损伤[24]。具体清除对象包括羟基自由基、1,1-二苯基-2-苦肼基自由基、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基以及超氧阴离子自由基,且清除能力与多糖浓度呈正比[25]。分子量达14 000 Da、1 g/L的APS溶液对羟自由基的清除率为14.83%[26]。此外,APS清除自由基的适宜pH值为5,且清除能力随着温度的升高而下降[27]。不同分子量(11.0、8.4、4.7和2.6 kDa)的APS均可以修复被草酸氧化损伤的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),降低细胞活性氧水平[28]。在饲料中添加适宜比例的APS可以提升黄颡鱼机体抗氧化功能[29];提高半滑舌鳎血液白细胞过氧化物酶活性、草鱼和罗非鱼总超氧化物歧化酶以及过氧化氢酶的活性[10,30-31]。添加APS可以显著提高虾血淋巴中酚氧化酶和超氧化物歧化酶的活性,降低丙二醛含量[32]。0.01%的APS可以显著降低斑马鱼肠道丙二醛含量,增强超氧化物歧化酶基因表达水平[33]。3%黄芪粉可以使刺参体腔液中超氧化物歧化酶活性显著升高[34]。2.2调控炎症反应APS能够通过多种信号途径调控炎症反应。如APS可以基于β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)依赖的方式拮抗脂多糖诱导的炎症反应[35],也可以抑制NOD样受体家族3(NLRP3)炎性小体和核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(NOD2)介导的炎症症状[36]。炎性因子Toll样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)、白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放会被抑制,而髓样分化因子88、核因子κBp65、肿瘤坏死因子-α和白IL-1β的表达被上调来发挥APS的抗炎作用[37-40]。此外,APS可以增强细胞中一氧化氮含量、IL-6和一氧化氮合酶(iNOS)等基因表达水平以及磷酸化p65、p38、c-Jun N-末端激酶和细胞外信号调节激酶的蛋白水平[41],提高MHCⅠ类和Ⅱ类分子水平来调控炎症反应[42]。对水产动物的研究发现,大菱鲆饲料中添加APS可以上调炎症基因髓样分化因子88、核因子Kappa-B p65、促炎症因子TNF-α和IL-1β的表达,抑制抗炎细胞因子转化生长因子β表达[38]。APS能够显著上调大黄鱼促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)的表达[43]。2.3促进细胞稳态APS对维持细胞的稳定状态发挥重要作用。如APS通过抑制蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、肌醇酶1α(IRE-1α)、转录激活因子(ATF6)所介导的内质网应激信号通路的活化,降低内质网应激标志蛋白(CHOP和GRP78)的表达水平来抑制线粒体ROS的积累,恢复内质网功能稳态;进而维持促凋亡和抗凋亡蛋白Bax/Bcl-2的平衡,减轻细胞凋亡[4,44-46]。APS也可以通过上调自噬相关蛋白Beclin-1来促进自噬标记蛋白胞浆型(LC3-Ⅰ)转变成自噬标记蛋白膜型(LC3-Ⅱ)以及下调自噬标记蛋白p62,增强细胞自噬活性[47]。一定量的APS和当归多糖配伍使用能够抑制维氏气单胞菌感染引起的细胞凋亡[48]。0.25 g/L的APS可以增强斑马鱼端粒酶基因TERT的表达,降低bax、p21、p53基因的表达,延缓斑马鱼细胞凋亡[49]。2.4改善免疫系统结构及功能APS对动物的免疫系统(免疫器官、细胞和分子)有直接影响。APS具有增加胸腺、脾脏和淋巴结相对重量,促进免疫器官发育,减少血管内皮生长因子和表皮生长因子受体的表达来改善免疫系统功能的作用[50-53]。APS也可以改善肠道形态,修复病毒感染导致的黏膜损伤,维持辅助型T细胞1/辅助型T细胞2(Thl/Th2)细胞动态平衡,上调小肠黏膜组织T-box基因家族新型转录因子(T-bet)和GATA基因家族转录因子(GATA-3)的蛋白表达,促进分泌型免疫球蛋白A(sIgA)分泌[54-55]。不同分子量APS修复免疫器官损伤的功能存在明显差异,其中以分子量为1.02×104 Da的APS效果为佳[56]。从免疫细胞角度来看,APS能够增强树突细胞对抗原的摄取、加工和递呈能力,提升巨噬细胞的数量及吞噬功能并促进腹腔巨噬细胞分泌白介素-2(IL-2),刺激自然杀伤细胞(NK细胞)增殖并增强其杀伤能力,增强机体红细胞免疫功能,提高白细胞水平[13]。APS也能够促进浆细胞分泌抗体,平衡T细胞亚群,增加血清免疫球蛋白含量,诱导白细胞介素和干扰素产生,增强病毒抗性[57]。投喂APS能够显著提高黄颡鱼头肾巨噬细胞的氧、氮呼吸爆发活性以及外周血白细胞的增殖能力[58]。APS可以促进鲤鱼外周血淋巴细胞的增殖[59],增加大鳞副泥鳅的红细胞数和白细胞数以及血清补体C3含量[60]。齐口裂腹鱼饲料中添加0.04% APS可以提高碱性磷酸酶活性,添加水平为0.06%时,酸性磷酸酶活性最高[61]。中低剂量(600~900 mg/kg)APS组半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均极显著增强[62]。2.5直接发挥抗细菌和抗病毒作用APS可以通过增加Toll样受体(TLR)的表达、调节肠道微生物菌群等来增强机体对嗜水气单胞菌等细菌的抵抗力[63-64],也可以刺激干扰素的形成来阻碍病毒蛋白合成,发挥抗病毒作用[57]。添加1% APS可以抑制维氏气单胞菌引起的鲫鱼细胞凋亡[48]。投喂APS添加饲料可以降低刺参因灿烂弧菌感染的累积死亡率[34]。以APS作为免疫佐剂与迟缓爱德华氏菌灭活疫苗配伍后免疫大菱鲆,大菱鲆的各项免疫指标明显提高,且以2.5 g/L APS混合疫苗免疫组的保护效率最高[65]。草鱼饲料中添加适量APS可以提高草鱼的抗病毒能力,治疗草鱼出血病[66]。如APS投喂草鱼母本可使其血液中免疫球蛋白M(IgM)、补体C3和溶菌酶(LSZ)的蛋白活性及基因表达水平提高,草鱼出血病发病减轻,死亡率降低;投喂APS的2月龄草鱼脾脏和头肾IgM基因表达水平显著升高。上述结果表明,APS能够提高草鱼母本的免疫能力并可以向子代传递,发挥对草鱼出血病病毒感染的免疫保护作用[67-68]。克氏原螯虾感染白斑综合征病毒后鳃、肝胰腺等组织出现细胞排列无序、破裂和核仁皱缩等病理变化;而添加0.8% APS试验组个体的鳃、肝胰腺组织未见明显病变,存活率提高26.67%[69]。饲料中添加0.01% APS可以改善斑马鱼的肠道健康和抗病毒免疫,但添加0.02%的APS会损害肝脏健康[33]。3展望向水产饲料中添加具有免疫增强功能的成分已成为促进水产动物健康的有效途径,APS为免疫活性较强的中草药成分,对推进水产动物饲料“替抗”具有很大潜力。不同结构APS的免疫功能存在差异,且已在一定程度上研究了APS对水产动物多方面免疫功能和疾病抗性的影响。APS的提取工艺和品质控制是其在未来水产饲料中应用开发的前提。APS的主要效用成分确定、与对应受体的互作特征、免疫效应机理以及对水产动物疾病抗性效果的准确评价是将来的研究聚焦点。

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