绿原酸（chlorogenic acid）是由咖啡酸（caffe acid）与奎宁酸（quinic acid）结合组成的缩酚酸，化学名为3-O-咖啡酰奎宁酸，分子式为C16O18H9[1-2]，易溶于极性溶剂，微溶于水，25 ℃时绿原酸在水中的溶解度约为4%[3]。绿原酸是常见的热敏多酚类化合物，强光照射或高温易发生水解[2]，在pH值约为3时最稳定[4-5]。绿原酸广泛存在于双子叶植物和蕨类植物体中[6]，具有多种生物活性[7-8]，是养殖业中有效的天然添加剂[9-14]。绿原酸生物功能的剂量效应显著[9]，应准确测定饲料中的绿原酸含量，但无专门针对饲料的检测方法。绿原酸检测方法有多种[15]，高效液相色谱法兼具定性和定量的功能，是不同行业的标准方法[16-18]。本试验采用高效液相色谱法测定饲料添加剂和饲料中绿原酸的含量，为绿原酸及其相关饲料产品的监督抽查提供合理的检测方法，为绿原酸在养殖业中的研究和应用提供技术支持。1材料与方法1.1仪器与设备LC-20A高效液相色谱仪（配紫外检测器，日本岛津公司）、Promosil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm，Ageia Technologies）、UV-1800紫外分光光度计（配1 cm比色池，日本岛津公司）、CP213电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）、SB-5200DT数控超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）、多位试管振荡器（德国heidolph公司）、TGL-20M台式高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）、氮吹浓缩仪（北京斯珀特科技有限公司）、固相萃取装置（Ageia Technologies）、混合型阴离子固相萃取柱（MAX，60 mg/3 mL，美国Waters公司）、0.22 μm GHP滤膜（13 mm，美国PALL公司）、Milli-Q 超纯水制备器（美国密理博有限公司）。1.2试剂与溶液绿原酸（100 mg，纯度99.73%，批号1081909，坛墨质检科技股份有限公司）、甲醇（High Purity Solvents，TEDIA公司）、磷酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。0.1%磷酸溶液配制：取1 mL磷酸于1 L容量瓶中，使用水定容至刻度并混匀；流动相为甲醇∶0.1%磷酸溶液为20∶80；样品提取液为50%甲醇溶液；MAX固相萃取柱的淋洗液为5%氨水溶液；MAX固相萃取柱的洗脱液为2%的甲酸甲醇溶液。标准溶液的配制：取全部绿原酸，使用少量甲醇溶解，使用甲醇定容至10 mL棕色容量瓶中，即为10 g/L的标准储备液，4 ℃冰箱中避光保存。根据需求将标准储备液用流动相稀释成不同浓度的标准工作液。1.3饲料添加剂前处理方法称取0.1~1.0 g（精确至0.001 g）饲料添加剂样品于烧杯中，加入适量流动相，超声溶解，冷却至室温，全部移入50 mL棕色容量瓶，使用流动相定容至刻度，过0.22 μm滤膜，供高效液相色谱仪测定。待测液中绿原酸含量超出标准工作液范围，适当稀释再测定。1.4饲料前处理方法1.4.1提取称取1.0~2.0 g（精确至0.001 g）饲料样品（配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料）于50 mL离心管中，加入20 mL 样品提取液，超声10 min，涡旋混合5 min，8 000 r/min离心5 min，收集上清液。向残渣中加入20 mL样品提取液，超声10 min，涡旋混合10 min，8 000 r/min离心5 min，合并上清液。上清液使用样品提取液定容至50 mL，混匀。1.4.2净化MAX固相萃取柱依次使用3 mL甲醇、3 mL 5%的氨水溶液活化，取5 mL提取液过柱，控制流速在1 mL/min内，依次使用3 mL纯水、3 mL甲醇淋洗，抽真空至近干，使用6 mL洗脱液洗脱，收集洗脱液。洗脱液于50 ℃水浴中氮气吹干，使用1 mL流动相涡旋溶解，过0.22 μm滤膜，混匀，供高效液相色谱仪测定。1.5色谱条件色谱柱为Promosil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流动相甲醇∶0.1%磷酸溶液为20∶80，等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量为20 μL，紫外检测器检测波长为327 nm。1.6计算公式绿原酸含量计算公式如下：W=C×Vm×f (1)式中：W为试样中绿原酸含量（mg/kg）；C为试液色谱峰对应的绿原酸浓度（mg/L）；V为定容体积（mL）；m为试样质量（g）；f为稀释倍数。2结果与分析2.1液相色谱条件（见图1、图2）使用流动相配制10 mg/L绿原酸溶液，利用紫外分光光度计在200~800 nm范围内扫描。由图1可知，溶液在约327 nm处吸收值最大，因此，紫外检测器的检测波长为327 nm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.023.F001图110 mg/L绿原酸溶液的紫外分光光度计扫描试验选择对绿原酸的保留性能更强的C18色谱柱[19]，选择的Promosil C18色谱柱，使用甲醇作为有机流动相，比乙腈有更长的保留时间和更优质的图谱。试验考察流动相的流速、流动相中甲醇的比例、柱温对保留时间的影响。结果显示，提高流速、甲醇的比例、柱温均使得绿原酸具有更短的保留时间和更窄的峰宽，综合考虑杂峰的影响和对色谱柱的保护，试验将设定流速为1.0 mL/min，甲醇比例为20%，柱温30 ℃。水相流动相中的pH值对峰形影响显著，提高水相中的酸含量，绿原酸的峰宽更窄，同浓度下的磷酸比甲酸、乙酸效果更好。水相中磷酸含量高于0.1%后，对改善峰形的效果不再明显，为了保护色谱柱，试验选择0.1%的磷酸作为水相。由图2可知，该色谱条件下绿原酸保留时间为6.49 min，且具有良好的峰形。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.023.F002图210 mg/L绿原酸的标准溶液色谱图2.2前处理方法（见图3、图4）绿原酸饲料添加剂以富含绿原酸的植物为原料[20]，其产品纯净，有效物质含量高。因此，绿原酸饲料添加剂使用流动相溶解、过膜后即可上液相色谱仪测试，操作简单、方便。配合饲料基质复杂，绿原酸含量低，使用流动相或其他溶液提取，不经净化处理，液相色谱的基线提高，绿原酸回收率低。试验分别测试流动相、不同比例的乙腈溶液和不同比例的甲醇溶液，发现50%甲醇溶液作为样品提取液，经两次提取步骤，绿原酸提取充分，回收率高，且不影响固相萃取柱的净化浓缩过程，操作流畅。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.023.F003图3绿原酸饲料添加剂液相色谱图试验使用MAX固相萃取柱进行净化和浓缩，固相萃取柱使用甲醇和5%的氨水溶液活化。绿原酸的pKa约3.91，使用5%的氨水溶液使固相萃取柱呈碱性，绿原酸离子化加强，更容易保留在柱子上。取5 mL提取液过柱，虽然饲料基质复杂，但该提取液可以顺利通过固相萃取柱。经水和甲醇淋洗，使用2%的甲酸甲醇溶液将绿原酸洗脱下来，甲酸、甲醇是低沸点液体，氮吹耗时短，氮吹温度设定为50 ℃，避免绿原酸的受热分解[21]。如图4可知，经过MAX固相萃取柱的净化和浓缩，液相色谱的基线更低，绿原酸的含量及响应值更高，达到净化和浓缩的目的。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.023.F004图4MAX固相萃取柱对仔猪配合饲料提取液中绿原酸的影响2.3线性关系和定量限（见图5、图6）考虑饲料中绿原酸含量，配制的绿原酸标准工作液的浓度分别为0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L，在上述色谱条件下测试。以绿原酸的质量浓度为纵坐标，以响应峰面积为横坐标，绘制标准曲线。由图5可知，标准曲线为y=ax+b，a=1.884 101×10-5，b=0.314 009 5。绿原酸在该范围内线性关系良好，相关系数为0.999 9。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.023.F005图5绿原酸标准曲线使用流动相逐级稀释低浓度饲料待测液，试验发现待测液中绿原酸的质量浓度为0.05 mg/L时，目标峰峰高约为10倍基线噪音值。因此，本方法的饲料定量限为0.25 mg/kg。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.023.F006图6饲料的定量限0.25 mg/kg色谱2.4稳定性（见表1）分别称取绿原酸饲料添加剂、仔猪配合饲料各1份，向仔猪配合饲料中加入绿原酸50 mg/kg，分别按1.3和1.4前处理方法处理，所得试液在液相色谱仪上连续进样7次，所得出峰时间和峰面积计算相对标准偏差，均低于0.5%，结果表明该方法稳定性良好。 10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.023.T001表1方法稳定性检验样品种类出峰时间/min相对标准偏差/%峰面积/mm2相对标准偏差/%绿原酸饲料添加剂6.470、6.467、6.466、6.469、6.471、6.471、6.4570.08516 895、520 401、521 380、515 059、520 425、518 102、515 4010.49仔猪配合饲料6.469、6.471、6.472、6.474、6.473、6.474、6.4710.03999 200、998 126、997 740、993 357、991 518、986 594、991 4720.46 2.5准确度和精密度（见表2）参照相关研究和推荐量[9,22]，分别向仔猪配合饲料和肉仔鸡配合饲料中加入不同水平的绿原酸，每个水平测定7次。由表2可知，绿原酸的加标回收率为98.1%~101.3%，相对标准偏差为1.6%~3.9%。结果表明，该方法准确度和精确度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.023.T002表2绿原酸的加标回收率和相对标准偏差（n=7）样品本底值/(mg/kg)添加量/(mg/kg)7次测定值/(mg/kg)回收率/%相对标准偏差/%仔猪配合饲料1.37200197、198、204、202、203、201、19699.41.62021.6、20.0、20.4、20.6、21.5、21.0、21.898.13.0肉仔鸡配合饲料1.123030.9、29.7、33.0、31.3、31.4、29.7、32.3100.23.934.04、4.28、4.39、3.98、4.07、4.14、4.22101.33.52.6饲料添加剂和饲料中绿原酸含量分析（见表3）由表3可知，试验检测以杜仲叶为主要原料生产的饲料添加剂，其中5%杜仲叶提取物为固体，其绿原酸含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.15.023.T003表3饲料添加剂和饲料中绿原酸测定结果类别名称绿原酸测定值/(mg/kg)性状饲料仔猪配合试料1.37育肥猪配合饲料2.45肉仔鸡配合饲料1.12肉鸡配合饲料0.25饲料添加剂5%杜仲叶提取物1 730固体3%杜仲叶提取物477液体1%杜仲叶提取物345液体3结论试验建立测定饲料添加剂和饲料中绿原酸含量的高效液相色谱法，该色谱条件下绿原酸保留时间为6.49 min，峰形良好，在0.1~50 mg/L范围内线性良好。该方法简单、方便、操作流畅，稳定性、准确度和精密度良好，检测饲料的定量限为0.25 mg/kg。因此，本试验建立的高效液相色谱法可以用于饲料添加剂和饲料中绿原酸含量的测定。