自2020年1月1日起，我国退出除中药以外的促生长类药物添加剂；自2020年7月1日起，各饲料企业停止生产含促生长类药物的饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料[1]。因此，替抗产品的研发成为研究热点。“饲用植物”是农业农村部相关文件批准的可以用于商品饲料生产的有一定应用功能价值的植物，收录于《饲料原料目录》[2]。饲用植物产品的具体表现形式有以干燥粉或粗提物为基础的饲料原料和以精提取物为基础的饲料添加剂[3]。其中，植物提取物中含有丰富的生物活性成分，具有绿色天然、毒副作用小、无耐药性以及低残留性等优点，成为最具发展前景的抗生素替代品之一[4-6]。蒲公英为菊科植物蒲公英（Taraxacummongolicum Hand.-Mazz.）、碱地蒲公英（Tarxacumborealisinense Kitam.）或同属数种植物的干燥全草[7]。蒲公英具有抑菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、利尿、抗过敏、抗血栓、保肝利胆、健胃等作用[8-11]，已被收录于《饲料原料目录》[2]。目前，对蒲公英指纹图谱已有研究[12-15]，但特征图谱的研究较少。指纹图谱是共性，得到的是能够标示该中药特性的共有峰的图谱。特征图谱是个性，通过选取色谱图中一些重要的特征信息，作为控制中药质量的重要手段，具有整体性、特征性及可量化等特点。特征图谱可以作为鉴定天然植物来源的有效手段，用于鉴别植物的真伪，评价药材的地道性以及制剂的稳定性与一致性，是非常有效的质量控制模式[16]。因此，本试验通过建立的蒲公英醇提物HPLC特征图谱，从特征峰的有无以及相对保留时间辨别蒲公英醇提物的真伪和合规性，为蒲公英醇提物的质量控制提供参考。1材料与方法1.1试验仪器Waters 2695高效液相色谱仪（Waters公司）；超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；十万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Unitary C18色谱柱：（4.6 mm×250 mm，5 µm）。1.2试验材料无水乙醇（General-Reagent）、色谱级乙腈（Merck）、甲酸、Milli-Q超纯水、咖啡酸（批号：110885-200102）、绿原酸（批号：110753-201415）、异绿原酸A（批号：111782-201706）。对照品均购自中国食品药品检定研究院；蒲公英对照提取物为湖南农业大学自制；蒲公英为购自亳州、安国和廉桥几大药材市场的干燥全草。30批蒲公英原料详细信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.022.T001表130批蒲公英采购信息样品编号产地采购地点样品编号产地采购地点1PGY-BZ-AH-05安徽安徽亳州16PGY-AG-HB-09湖北河北安国2PGY-BZ-AH-07安徽安徽亳州17PGY-AG-HB-11湖北河北安国3PGY-BZ-AH-02安徽安徽亳州18PGY-AG-HN-10湖南河北安国4PGY-BZ-SX-02山西安徽亳州19PGY-AG-HN-6湖南河北安国5PGY-BZ-HN-01湖南安徽亳州20PGY-AG-HN-04湖南河北安国6PGY-BZ-AH-01安徽安徽亳州21PGY-AG-HB-07湖北河北安国7PGY-BZ-AH-03安徽安徽亳州22PGY-AG-HB-13湖北河北安国8PGY-BZ-GS-02甘肃安徽亳州23PGY-AG-HB-05湖北河北安国9PGY-BZ-HN-02湖南安徽亳州24PGY-AG-HN-08湖南河北安国10PGY-BZ-GS-03甘肃安徽亳州25PGY-AG-HN-12湖南河北安国11PGY-BZ-AH-06安徽安徽亳州26PGY-AG-HN-02湖南河北安国12PGY-BZ-AH-04安徽安徽亳州27PGY-AG-HB-01湖北河北安国13PGY-BZ-GS-01甘肃安徽亳州28PGY-LQ-AH-01安徽湖南廉桥14PGY-BZ-SX-01山西安徽亳州29PGY-LQ-GS-02甘肃湖南廉桥15PGY-AG-HB-03湖北河北安国30PGY-LQ-SX-03陕西湖南廉桥1.3试验方法1.3.1色谱条件Waters 2695高效液相色谱仪，Unitary C l8色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B；流速为1 mL/min；柱温为40 ℃；检测波长为323 nm；梯度洗脱条件为：0~25 min，9%~12% A；25~30 min，12%~20% A；30~50 min，20%~27% A；50~55 min，27%~35% A；55~60 min，35%~50% A；60~65 min，50%~90% A；进样量10 μL。1.3.2供试品的制备分别将30批次合规来源的蒲公英粉碎物过1号筛（10目）。取过筛后粉碎物100 g，采用800 mL的70%乙醇回流提取1次，采用500 mL的70%乙醇回流提取1次，每次1 h，合并两次提取液并过滤，滤液减压回收乙醇至浓稠的膏状，60 ℃烘干，研磨粉碎，即得蒲公英醇提物试品。1.3.3溶液的制备1.3.3.1供试品溶液的制备称取蒲公英醇提物约0.2 g，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液25 mL，超声（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称定重量，使用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，静置。上清液使用0.22 μm的滤膜过滤，取滤液于液相色谱瓶中。1.3.3.2参照物溶液的制备分别精密称定咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A标准品5 mg，置于25 mL的棕色容量瓶中，加入甲醇超声溶解、并定容至刻度线，制成0.2 g/L的参照物储备溶液，于4 ℃冷藏。1.3.4方法学考察1.3.4.1精密度试验取质控样品约0.2 g，按“1.3.3.1项”下方法制备供试品溶液，连续进样6次，进样10 μL。使用仪器自带软件的积分功能对6个特征峰进行积分获得保留时间和峰面积，以色谱峰3（咖啡酸）为参照峰（S），计算各特征峰的相对峰面积和相对保留时间的相对标准偏差，各特征峰与S峰相对保留时间RSD3%，相对峰面积RSD5%，说明该方法的精密度良好。1.3.4.2稳定性试验取质控样品约0.2 g，按“1.3.3.1项”下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样10 μL。以色谱峰3（咖啡酸）为参照峰（S），计算各特征峰的相对峰面积和相对保留时间的相对标准偏差，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD3%，相对峰面积RSD5%，说明该方法稳定性好。1.3.4.3重复性试验取质控样品约0.2 g，按“1.3.3.1项”下方法平行制备6份供试品溶液，进样10 μL。以色谱峰3（咖啡酸）为参照峰（S），计算各特征峰的相对峰面积和相对保留时间的相对标准偏差，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD3%，相对峰面积RSD5%，说明该方法的重复性良好。2结果与分析2.1对照特征图谱的建立将30批蒲公英醇提物样本，按照“1.3.3.1项”下方法制备好供试品溶液，再按照“1.3.1”项下色谱条件进行检测，得到色谱图。利用仪器自带的处理软件对所有色谱图进行叠加，选择色谱图上不同保留时间段且响应较好的6个共有色谱峰标定为特征峰，结果见图1。标定的6个特征峰在所有批次样本中均能被识别与积分。再将色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012年版），将“时间窗宽度”设置为0.2，进行多点校正，处理图谱，再次确认6个特征峰在所有批次样本中均能被识别，结果见图2。建立蒲公英醇提物特征图谱的对照图谱（R），结果见图3。结合以上两种方式验证，最终确认6个共有特征峰，按其出峰顺序标记为1~6号峰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.022.F001图1仪器自带软件对30批蒲公英醇提物的手动叠加图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.022.F002图2相似度评价系统软件对30批蒲公英醇提物的叠加图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.022.F003图3蒲公英醇提物对照特征图谱2.2特征峰的指认与参照峰的选择根据查阅药典和文献等相关资料，选择蒲公英中主要有效成分咖啡酸、绿原酸和异绿原酸A对照品。与咖啡酸、绿原酸和异绿原酸A对照品色谱峰进行比对，确定色谱峰2、色谱峰3和色谱峰5分别为绿原酸、咖啡酸和异绿原酸A。鉴于药典中蒲公英含量测定对照物为咖啡酸，因此设定其为参照峰（S峰）。2.3特征峰的相对保留时间（见表2）由表2可知，各特征峰相对保留时间的平均值，分别为0.593、0.803、2.388、2.598、2.776 s，将此平均值设定为各特征峰相对保留时间的规定值。蒲公英各批次样品特征峰的相对保留时间RSD均低于0.3%，表明特征峰的出峰时间相对稳定，一定程度上体现其质量的稳定性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.022.T002表230批蒲公英醇提物特征图谱中6个特征峰的相对保留时间样品编号峰1峰2峰3峰4峰5峰6RSD/%0.1660.1290.2430.2440.22210.5930.8021.0002.3932.6092.78820.5930.8021.0002.3912.6072.78630.5920.8021.0002.3852.6072.78540.5940.8051.0002.3842.5932.77050.5940.8031.0002.3912.6002.77760.5950.8041.0002.4032.5982.77970.5930.8041.0002.3892.6002.77880.5930.8031.0002.3892.6022.78190.5930.8041.0002.3902.5912.774100.5920.8031.0002.3862.5982.776110.5920.8031.0002.3842.5962.774120.5960.8001.0002.4022.6122.791130.5920.8031.0002.3832.5952.773140.5920.8041.0002.3882.5992.777150.5920.8031.0002.3802.5922.769160.5920.8031.0002.3892.6012.778170.5930.8041.0002.3912.5972.773180.5920.8031.0002.3922.6032.781190.5930.8031.0002.3922.5962.775200.5930.8031.0002.3982.6042.781210.5920.8041.0002.3862.5942.771220.5940.8041.0002.3842.5952.773230.5930.8031.0002.3892.5992.778240.5920.8031.0002.3812.5952.773250.5940.8041.0002.3822.5902.768260.5930.8041.0002.3832.5942.771270.5930.8041.0002.3802.5902.768280.5930.8051.0002.3832.5832.767290.5930.8051.0002.3862.5912.769300.5940.8041.0002.3902.5942.772平均值0.5930.8031.0002.3882.5982.7762.4特征峰的相对峰面积（见表3）由表3可知，各批次普通硬醇提物特征峰的峰面积差异较大，反映不同批次蒲公英样品的差异性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.022.T003表330批蒲公英醇提物特征图谱中6个特征峰的相对峰面积样品编号峰1峰2峰3峰4峰5峰6RSD/%43.06249.21448.880175.01184.84817.3021.8861.00021.7410.1530.39325.5871.5761.00023.7300.3600.63136.4242.1821.00027.2500.2470.47743.1600.3321.0005.3080.1100.20856.6330.9651.00011.0440.2060.41668.6962.7031.0005.9770.3020.53274.4780.5071.0007.5590.0910.23183.8090.8481.00010.5430.2300.369910.1331.6301.0009.8670.7770.404104.1650.6291.0009.6190.1710.302117.4261.4771.00013.5870.0940.336123.9950.7791.0009.7780.1950.310134.1700.7751.00010.3980.1920.371143.4470.4721.0007.0330.1190.242153.6260.7121.0009.2800.2150.308165.4430.9571.00013.3270.1740.397176.1471.0121.0007.7930.2610.441184.3890.8801.0008.5030.1880.398193.1990.9591.0004.2860.5750.453209.4030.9941.0008.5830.4120.742214.8860.6821.0006.9610.1580.289226.4650.8961.00017.3260.0720.183234.8260.9241.00012.8150.1940.315244.9130.6171.00011.3900.2070.3722511.0051.5311.00019.6830.3880.7472610.4521.3881.00018.1800.2590.5472711.4531.9131.00021.8360.2230.478289.0850.8821.0008.0193.9670.4322913.5831.1761.00017.5351.0702.515307.1640.9251.0007.7910.4910.6413讨论3.1粗提物的选择天然植物粗提物具有水提物和醇提物两种形态，在最初的粗提物制作中，制备了水提物和70%的醇提物。结果显示，水提物的液相图谱中化合物数量较醇提物少，且蒲公英醇提物所选择的特征峰在30批次蒲公英粉末重叠图谱中均能找到，故选择蒲公英醇提物作为研究对象。3.2提取方式的优化蒲公英醇提物由70%乙醇回流提取、浓缩干燥后得，其主要成分易溶于70%乙醇，因此选用70%浓度的乙醇作为提取溶剂。通过考察0.1、0.2、0.5 g不同称样量，加入25 mL 70%乙醇超声30 min，进行HPLC分析，表明称样量在0.2 g时供试品能全部溶解且具有较好的色谱峰响应。3.3色谱条件的优化3.3.1流速的考察取质控样品溶液，分别考察0.8、1.0、1.2 mL/min不同流速对蒲公英醇提物中主要有效成分分离的影响。流速越大，物质出峰时间更紧凑，响应高；而小流速会拉长分析的时间，且造成峰拖尾，响应低等后果。结果表明，1.2 mL/min的流速导致一些成分没能彻底分离，0.8 mL/min的流速分离效果与1.0 mL/min相近，但整个分离过程太长，所以选择的流速为1.0 mL/min。3.3.2柱温的考察取质控样品溶液，考察30、35、40 ℃的柱温对蒲公英醇提物分离的影响，但三者对其主要有效成分的分离区别不大，且柱温40 ℃时色谱峰出峰时间更早，缩短分析时间，所以参照药典选择柱温40 ℃ 。3.3.3进样量的考察取质控样品溶液，分别考察进样量3、5、10 μL对蒲公英醇提物主要有效成分分离的影响。结果表明，3 μL和5 μL的进样量太少导致其有效成分响应低，所以选择10 μL作为本试验的进样量。3.3.4特征图谱质量控制因为本试验的蒲公英样本购自不同的药材市场，其品质受到自身遗传因素、外在生态环境因素以及人为干预的影响。不同的产地、采收日期或栽培方式均可能造成蒲公英质量的参差不齐，导致相对峰面积比值差异较大。所以，本研究对特征峰与S峰相对峰面积比值的范围不做硬性要求。因此，可以通过固定生产地、采收期等措施，实现植物原料及其粗提物质量的稳定可控。这时可以对特征图谱中的特征峰与S峰的相对峰面积比值范围进行限定，保障饲用植物质量的稳定和可控性[17-18]。4结论本试验从不同药材市场收集30批次蒲公英样品，将其制备成醇提物，并对30批醇提物进行分析，由此建立HPLC特征图谱。通过对照其特征图谱整体图形、共有特征峰、相对保留时间等参数对蒲公英醇提物快速进行鉴定，说明该方法是1种高效的质量控制方法。