皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）是我国最具经济价值的鲍类之一[1]。目前，广泛采用浅海筏式养鲍[2]。大规格鲍苗下海养殖可以提高成活率、缩短养成周期、提高效益[3]。因此，延长室内鲍苗培育周期、获得大规格高品质鲍苗尤为重要。但是，室内高密度培育会导致鲍苗疾病易发而减产[4]。目前，已开展哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）胁迫对皱纹盘鲍抗氧化及免疫功能影响的研究[5]，也有饲料中添加α-硫辛酸[6]、谷胱甘肽[6]、中草药[7]、维生素[8]、吡哆醇[9]、矿物元素及糖类[10-12]等对皱纹盘鲍生长、抗氧化能力及免疫指标生理相关研究的报道。益生菌有促进水生动物生长、提高抗氧化能力和免疫力等作用[13-14]。沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）富含蛋白质、维生素等活性物质，是水产动物的绿色饵料，可以促进水产动物生长，提高抗氧化能力和免疫力[15]。研究发现，配合饲料中加入沼泽红假单胞菌，可以有效促进罗非鱼（Oreochromis spp）[16-17]、对虾（Penaeus orientalis）[18]、月鳢（Channa asiatica）[19]生长，提高机体非特异性免疫力。养殖水体中添加沼泽红假单胞菌可以促进草鱼（Ctenopharyngodon idella）、鲫鱼（Carassius auratus）生长，增强抗氧化及免疫功能[20-21]。在三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）养殖水体中添加球形红假单胞菌（Rhodopseudomonas spheroids）可以改善水质、减少病害[22]、促进生长、提高免疫力[23]。但是，目前尚未有关于沼泽红假单胞菌对皱纹盘鲍生长性能、抗氧化能力及非特异性免疫影响研究的报道。本试验研究沼泽红假单胞菌不同添加量对纹盘鲍幼鲍生长性能、抗氧化能力及非特异性免疫酶活性的影响，确定沼泽红假单胞菌的适宜添加量，为沼泽红假单胞菌在鲍养殖生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料实验室连续扩培沼泽红假单胞菌，获得有效活菌数超过5.0×109 CFU/mL的菌悬液，制成干菌粉备用。皱纹盘鲍为取自青岛前沿海洋种业有限公司的同批次、同规格、健康无病的个体，初始平均壳长为（11.19±1.05）mm，初始体重为（0.17±0.06）g。1.2试验设计4 500只试验幼鲍随机分为5组，标记为R0（对照组）、R1、R2、R3、R4组，每组3个重复，每个重复300只。分别向幼鲍基础饲料中添加0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%的沼泽红假单胞菌干菌粉，充分混匀，采用125型两压辊饲料颗粒机加工制成40目、20目的颗粒饲料，60 ℃烘箱中烘干，冷却，分装，保存于-20 ℃冰箱，用于幼鲍饲喂试验。基础饲料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.010.T001表1基础饲料组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量营养水平总计100.00鱼粉24.70粗蛋白30.40豆粕21.50粗脂肪4.58螺旋藻粉2.50小麦粉16.50海带粉26.80豆油1.00鱼油1.00维生素2.50矿物质3.00氯化胆碱0.50注：1.维生素和矿物质购自威海金牌生物科技有限公司。2.营养水平均为计算值。%1.3饲养管理试验开始于2020年7月20日，共计90 d。分别向1.0 m×0.6 m×0.5 m的玻璃钢养殖槽中各投放300只幼鲍。采用自然光照及24 h流水，保持水温18.0~20.5 ℃、盐度31.2‰~32.6‰、pH值7.7~7.9、溶解氧大于6 mg/L。每天8：00清污，并记录各组幼鲍死亡数；每天17：00投喂幼鲍体重3%~5%的试验饲料，每天记录投饵量、收集残饵，并根据鲍规格、摄食情况等及时调整投喂量。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能试验结束时，每组随机取50只幼鲍，用游标卡尺测量获得壳长（mm），电子秤称量获得体重（g），并记录死亡个数（个）。根据测得的壳长、体重、存活个数、总摄食量，计算幼鲍的壳长特定生长率（LsGR）、体质量特定生长率（WsGR）、增重率（WGR）、存活率（SR）、摄食率（FR）、饲料效率（FER）、蛋白质效率（PER）。LSGR(%/d)=(lnLt-lnLi)/t×100(1)WSGR(%/d)=(lnmt-lnm0)/t×100(2)WGR=(mt-m0)/m0×100%(3)SR=Nt/N0×100%(4)FR(%/d)=Wf/[t×(M0+Mt)/2]×100(5)FER=(Mt-M0)/Wf×100%(6)PER=(Mt-M0)/(Wf×Ppr)(7)式中：Li、Lt分别为初始、终末壳长（mm）；t为试验天数（d）；mt、m0分别为幼鲍的平均初重、末重（g）；N0、Nt分别为皱纹盘鲍幼鲍的初始、终末存活个数（个）；Wf为总摄食量（g）；M0、Mt分别为幼鲍的初重、末重（g）；Ppr为饲料中蛋白质含量（%）。1.4.2抗氧化及非特异性免疫指标试验结束时，每组随机取30只幼鲍，采用腹足创伤法取血淋巴，冰箱4 ℃过夜，5 000 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃超低温冰箱内保存备用。使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定幼鲍血清超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量；测定血清碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、酚氧化酶（PO）、溶菌酶（LZM）活性，具体测定方法参照使用说明书。1.5数据统计与分析数据采用SPPS 26.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan氏法多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1沼泽红假单胞菌对皱纹盘鲍幼鲍生长性能的影响（见表2）由表2可知，随沼泽红假单胞菌添加量增大，幼鲍的存活率、壳长特定生长率、体质量特定生长率、增重率、饲料效率、蛋白质效率均先增大后减小，R1、R2、R3、R4组均显著大于R0组（P0.05）。其中，R3组存活率、壳长特定生长率、体质量特定生长率、增重率、饲料效率、蛋白质效率最大，均显著高于其他各试验组（P0.05）。而随沼泽红假单胞菌添加量增大，摄食率先减小后增大，各试验组显著小于R0组（P0.05）。其中，R3组摄食率最小，显著低于其他试验组（P0.05）。研究表明，饲料中添加沼泽红假单胞菌可以显著提高幼鲍壳长、体重增长，促进幼鲍存活，提高饲料利用效率，且以0.75%的添加量最优。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.010.T002表2沼泽红假单胞菌对皱纹盘鲍幼鲍生长性能的影响项目R0组（对照组）R1组R2组R3组R4组存活率/%93.31±2.89e97.50±0.50c98.20±1.00b99.00±0.76a96.80±0.50d初始壳长/mm11.20±1.0511.20±1.0511.20±1.0511.20±1.0511.20±1.05终末壳长/mm25.39±2.01e25.52±2.62d26.03±1.95b26.94±1.89a25.70±2.04c壳长特定生长率/(%/d)0.91±0.04d0.92±0.05c0.94±0.03b0.98±0.05a0.92±0.03c初重/g0.17±0.060.17±0.060.17±0.060.17±0.060.17±0.06末重/g2.27±0.19e2.33±0.21d2.47±0.17b2.68±0.24a2.42±0.16c体质量特定生长率/(%/d)2.88±0.06e2.91±0.05d2.97±0.06b3.06±0.04a2.95±0.04c增重率/%1 235.29±54.12e1 270.59±49.37d1 352.94±58.31b1 476.47±55.76a1 323.53±48.63c总摄食量/g1 215.501 254.741 245.061 303.681 251.39摄食率/(%/d)3.94±0.05a3.81±0.04b3.55±0.05d3.42±0.06e3.69±0.04c饲料效率/%48.08±1.46e50.25±1.57d54.35±1.43b57.14±1.52a52.08±1.33c蛋白质效率1.58±0.03d1.65±0.04c1.79±0.03b1.88±0.04a1.71±0.02b注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2沼泽红假单胞菌对皱纹盘鲍幼鲍血清抗氧化能力的影响（见表3）由表3可知，随沼泽红假单胞菌添加量增大，幼鲍血清T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性均先增大后减小；R1、R2、R3、R4组T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性均显著高于R0组（P0.05）。其中，R2、R3组T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性均维持在相对较高水平，且R3组活性均最大（P0.05）。随沼泽红假单胞菌添加量增大，幼鲍血清MDA含量则先减小后增大；各试验组MDA含量均显著低于R0组（P0.05），R3组MDA含量最小（P0.05）。研究表明，饲料中添加沼泽红假单胞菌显著影响幼鲍血清T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px、MDA活性，且添加量不同效果差异显著，以0.75%添加量抗氧化能力最优。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.010.T003表3沼泽红假单胞菌对皱纹盘鲍幼鲍血清抗氧化能力的影响组别T-AOC/(U/mL)SOD/(U/mL)CAT/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)MDA/(μmol/L)R0组（对照组）1.61±0.03e60.71±2.30e2.71±0.05e40.65±0.70e4.15±0.31aR1组1.69±0.04d62.23±2.11d2.82±0.10d41.93±0.41d3.96±0.25bR2组1.87±0.04b67.10±1.93b3.50±0.10b44.86±0.33b3.65±0.23cR3组1.96±0.05a69.51±2.10a3.83±0.20a46.22±0.40a3.53±0.21eR4组1.76±0.03c64.24±2.21c3.05±0.20c42.84±0.51c3.84±030d注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3沼泽红假单胞菌对皱纹盘鲍幼鲍非特异性免疫酶活性的影响（见表4）由表4可知，随沼泽红假单胞菌添加量增大，幼鲍血清AKP、ACP、PO、LZM活性均先增大后减小；R1、R2、R3、R4组AKP、ACP、PO、LZM活性均显著高于R0组（P0.05）；其中，R2、R3组AKP、ACP、PO、LZM活性均维持在相对较高水平，R3组活性均最大（P0.05）。研究表明，饲料中添加沼泽红假单胞菌显著影响皱纹盘鲍幼鲍血淋巴AKP、ACP、PO、LZM活性，且添加量不同效果差异显著，以0.75%添加量非特异性免疫力最优。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.010.T004表4沼泽红假单胞菌对皱纹盘鲍幼鲍非特异性免疫酶活性的影响组别AKP/(King's/100 mL)ACP/(King's/100 mL)PO/(U/mL)LZM/(U/mL)R0组（对照组）6.03±0.41e11.57±0.70e2.56±0.05e2.83±0.11dR1组6.40±0.35d11.93±0.41d2.75±0.10d3.22±0.30cR2组7.61±0.43b14.86±0.33b2.99±0.10b3.81±0.31bR3组8.15±0.51a16.22±0.40a3.25±0.20a4.04±0.42aR4组6.94±0.60c12.84±0.51c2.84±0.20c3.35±0.29c3讨论3.1沼泽红假单胞菌对皱纹盘鲍幼鲍生长性能的影响光合细菌可以作为水生动物配合饲料的营养增强剂，调节肠道菌群和消化功能[24-25]，促进水产动物生长及存活，且不同水生动物适宜添加量有差异[26]。沼泽红假单胞菌作为光合细菌的代表菌种之一，具有营养丰富、蛋白含量高等优点，能够抑制水生动物体内有害菌生长，促水生动物其消化吸收[16]。饲料中添加3%~7%的沼泽红假单胞菌可以促进罗非鱼生长，提高存活率，提高饲料利用效率，且以5%添加量效果最佳[16]。饲料中添加0.5%~1.0%的沼泽红假单胞菌可以显著改善草鱼的生长性能，降低饲料系数，但不同添加量对生长性能影响并不显著[20]。本研究发现，鲍配合饲料中添加0.25%~1.00%的沼泽红假单胞菌，幼鲍FR下降，但摄食单位质量的饲料利用率高；显著提高皱纹盘鲍幼鲍LsGR、WsGR、WGR，提高FER、PER；以0.75%添加量最优。本研究结果与前人研究结果基本一致，但最适添加量不同。原因可能与沼泽红假单胞菌菌株特性、活菌数及添加量有关。另外，水生动物种类不同、基础饲料不同，也会导致试验结果不同。3.2沼泽红假单胞菌对皱纹盘鲍幼鲍抗氧化能力的影响T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px是反映动物机体抗氧化能力的关键指标[27-28]，可以通过多种途径消除动物机体内氧自由基，提高机体抗氧化能力，促进动物健康生长[29-30]。MDA反映机体氧化损伤程度[27-28]。沼泽红假单胞菌可以改变水生动物肠道菌群结构，促进血液的形成，增强机体抗氧化能力，提高抗病能力[15]。刘小燕等[20]研究表明，饲料中添加0.5%~1.0%沼泽红假单胞菌可以提高草鱼SOD、CAT活性，降低MDA含量，增强草鱼抗氧化能力。邵林等[21]研究发现，水体中添加3.0×108 CFU/mL沼泽红假单胞菌可以降低乌鳢MDA含量，减少机体抗氧化损伤，增强抗氧化能力。沈文英等[31]研究发现，芽孢杆菌（Bacillus）通过提高三角帆蚌的SOD活性增强机体抗氧化能力。本研究发现，鲍配合饲料中添加0.25%~1.00%的沼泽红假单胞菌，显著提高T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA含量，与前人研究结果基本一致；添加量为0.75%时，T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性最大，MDA含量最小。本试验最适添加量与前人研究有所不同，可能因为沼泽红假单胞菌对不同水生动物的抗氧化能力的影响有所差异。3.3沼泽红假单胞菌对皱纹盘鲍幼鲍非特异性免疫指标的影响氧化酶类、抗氧化酶类、水解酶类等对水生无脊椎动物非特异性免疫发挥着重要作用，可以维持水产动物生理功能、防御病原入侵、提高抗病性[28-29,32]，是评价免疫状态的重要指标[33-34]。ACP、AKP、LZM均参与生物机体的免疫[31,35-37]。PO在软体动物非特异性免疫中具有重要作用，反映机体的免疫防御状态[38]。沼泽红假单胞菌作为益生菌，能够抑制有害菌繁殖，减少有害物质产生，提高机体免疫力和抗病力[15]。王赛赛等[39]研究发现，饲料中添加0.5%复合益生菌时，大口黑鲈（Micropterus salmoides）的AKP、ACP活性最高。刘淑兰等[40]研究发现，饲料中添加复合益生菌制剂可显著提高大西洋鲑（Salmo salar）血清ACP、LZM活性。文国梁等[41]研究发现，饲料中添加0.2%中草药+0.3%芽孢杆菌，凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）PO活性最高。刘小燕等[20]研究发现，在饲料中添加0.5%~1.0%沼泽红假单胞菌，可以提高AKP、LZM活性，提高水生动物免疫力。本研究发现，配合饲料中添加沼泽红假单胞菌可以提高幼鲍AKP、ACP、PO、LZM活性，与前人的研究结果基本一致；添加量为0.75%时，AKP、ACP、PO、LZM活性均最大，与前人研究有所不同。原因可能是沼泽红假单胞菌不同添加量对不同种类、不同养殖时期的水生动物的非特异性免疫酶活性影响不同，也可能与添加的菌株特性等有关。4结论饲料中添加沼泽红假单胞菌可以显著提高皱纹盘鲍幼鲍的生长性能、抗氧化能力及非特异性免疫功能，以0.75%添加量最优。