大环内酯类药物（macrolides，MALs）是一类重要的抗生素类群，结构中含有十二元、十四元或十六元内酯环母核，并通过苷键连接中性或碱性糖链，其理化性质和生物学效应相似。MALs可以用于治疗动物细菌性感染，还可促进动物生长，提高饲料的转化率[1]，在兽药及饲料领域得到广泛应用。但是，考虑到饲料药物添加剂的安全性，欧盟陆续从动物饲料允许的添加剂注册表中删除部分MALs[2]。在我国公布的GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药残留最大限量》对动物组织中MALs的限量也有明确的规定[3]。动物长期食用此类抗生素体内会产生蓄积，而后该抗生素通过食物链进入人体，对人类健康构成严重威胁[4-5]。因此，建立简单、高效的饲料中MALs的检测方法，对从源头上保障动物源食品的质量安全具有重要意义。MALs的分析领域广泛，分析手段逐渐复杂，分析的种类趋于多样化。目前，MALs的检测方法主要包括微生物法[6-7]、毛细管电泳法[8]、液相色谱法（LC）[9-10]、液相色谱-串联质谱法（LC—MS/MS）[11-13]等。MALs的检测对象主要针对畜禽肉制品、水产品、牛奶、蜂蜜等动物源性食品[14-16]。由于饲料基质复杂，存在蛋白质、脂肪、色素、糖类等干扰，以饲料为分析对象的相关研究较少。目前，尚未有关于饲料中MALs检测的国家及行业标准。本方法着重对分析方法进行改进和优化，建立配合饲料中MALs的检测方法。配合饲料中红霉素、罗红霉素、竹桃霉素、泰乐菌素、替米考星、交沙霉素均采用乙腈提取，磷酸盐缓冲液稀释后HLB固相萃取柱净化，洗脱液经50 ℃氮吹浓缩至近干，1.0 mL甲酸水-乙腈溶液复溶，0.2 μm滤膜过滤后超高效液相色谱-串联质谱外标法定量测定。本方法可以为配合饲料中MALs含量的分析及检测提供参考。1材料与方法1.1仪器与设备I-class超高效液相色谱和TQS三重四级杆串联质谱仪（美国waters公司）、离心机（美国Thermo公司）、固相萃取装置（美国waters公司）、MD 200氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）、pH计（梅特勒-托利多公司）、涡旋振荡器（德国IKA公司）、HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，美国waters公司）、GHP微孔滤膜（0.2 μm，美国waters公司）。1.2材料与试剂乙腈（色谱级，Merck）；甲酸（色谱级，Sigma-Aldrich公司）；磷酸氢二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；替米考星、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素、竹桃霉素标准物质（纯度≥95%，德国Dr. Ehrenstorfer公司）。磷酸盐缓冲溶液（pH值8.0）：称取6.0 g磷酸氢二钠溶解于450 mL水中，利用氢氧化钠调节pH值至8.0，使用水定容至500 mL，摇匀，即得。1.3仪器条件1.3.1液相色谱条件色谱柱：BEH C18柱，2.1 mm×50 mm，1.7 μm；柱温：40 ℃；进样量：1 μL；流速：0.30 mL/min；梯度洗脱程序见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.023.T001表1梯度洗脱程序表时间/min0.1%甲酸溶液/%乙腈/%初始80204.020805.020805.180206.080201.3.2质谱条件电离模式：电喷雾正离子；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：350 ℃；脱溶剂氮气流速：800 L/h；检测方式：多反应监测（MRM）。6种大环内酯类药物MS/MS条件见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.023.T002表26种大环内酯类药物MS/MS条件项目定量离子定性离子/(m/z)锥孔电压/V碰撞能量/eV替米考星869.5174.4869.5174.4869.5156.635355040泰乐菌素916.5174.2916.5174.2916.5772.720201515红霉素734.6158.5734.6158.5734.6576.518181317罗红霉素837.6679.6837.6679.6837.6158.420201422交沙霉素828.8174.3828.8174.3828.8229.330301414竹桃霉素688.6158.4688.6158.4688.6544.6252513191.4样品前处理称取2 g试样置于50 mL离心管中，准确加入10 mL乙腈，涡旋，超声提取10 min，10 000 r/min离心10 min。取上清液2 mL，加入10 mL磷酸盐缓冲溶液，过HLB固相萃取柱，3 mL水淋洗，使用3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液。将洗脱液50 ℃氮吹浓缩至近干，准确加入1.0 mL甲酸水-乙腈溶液（体积比1∶1）溶解，涡旋混匀，经0.2 μm滤膜过滤，超高效液相色谱-串联质谱仪测定。2结果与分析2.1提取液的确定MALs的结构决定其易溶于具有一定极性的有机溶剂，如甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等，在水微溶。但MALs在酸性（pH值4）条件下苷键易发生水解；碱性条件（pH值9）下内酯环易开裂。本试验选取甲醇、乙腈、乙酸乙酯3种溶剂比较其提取效率。只有乙腈为提取液时，6种药物的回收率为90%~104%，且乙腈可以沉淀饲料中的蛋白，明显减少其他杂质的干扰。所以，选定乙腈作为提取溶剂。2.2净化方法的确定提取溶剂为乙腈，直接过HLB固相萃取柱洗脱能力较强，大环内酯类药物的不易保留。因此，上样之前需进行溶剂转换或稀释。试验中比较提取液氮吹至近干纯水溶解、提取液氮吹至近干纯磷酸盐溶液溶解（pH值=8.0）、2 mL提取液加入10 mL水稀释、2 mL提取液加入10 mL磷酸盐溶液（pH值=8.0）4种不同方法对回收率的影响。吹至近干后，大环内酯类药物的水溶解不完全，回收率均较低。使用2 mL提取液加入10 mL磷酸盐稀释过固相萃取柱时，6种大环内酯的回收率为90%~110%。由于各种饲料的组成不同，pH值可能存在较大差异。因此，选择具有缓冲能力的磷酸盐缓冲溶液作为稀释液，以减少饲料组成不同对pH值造成的影响。2.3基质效应（见表3）基质效应指基质成分和目标化合物在电喷雾离子源进行离子化时，相互竞争而导致目标化合物的信号强度有不同程度的增强或减弱。以空白基质中标准物质的峰面积（A）和相对应浓度的溶剂标准物质的峰面积（B）之比考察基质效应（ME）[17]。由表3可知，MALs在配合饲料中既存在基质抑制效应，也存在基质增强效应，但以基质增强效应为主，尤其是替米考星在配合饲料中的基质效应达到59.6%。因此，方法采用配制基质匹配标准溶液的方法以消除基质影响，回收率满足测定的要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.023.T003表3配合饲料大环内酯类药物基质效应项目红霉素罗红霉素竹桃霉素泰乐菌素替米考星交沙霉素ME24.934.2-0.916.859.624.3注：负值表示存在基质抑制效应，正值表示存在基质增强效应，绝对值越大则基质效应越强。%2.4线性范围、检出限和定量限（见表4）采用空白基质配制一系列标准工作溶液，以6种MALs的定量离子峰面积（y）为纵坐标，相应的质量浓度（x，μg/L）为横坐标进行线性回归；以信噪比（S/N）≥3确定检出限（LOD），S/N≥10确定定量限（LOQ）。由表4可知，6种MALs均呈良好的线性关系，相关系数均大于0.99，方法检出限为5 μg/kg，定量限为10 μg/kg。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.023.T004表4配合饲料大环内酯类药物的基质标准曲线及线性范围项目范围/(μg/L)线性方程相关系数红霉素1~200y=11 060.2x-2 429.70.999罗红霉素1~200y=24 114.5x+4 176.740.999竹桃霉素1~200y=22 884.4x-4 167.660.999泰乐菌素1~200y=6 611.16x+5 896.010.999替米考星1~200y=4 211.97x+11 545.20.999交沙霉素1~200y=14 252.3x+937.7370.99910 μg/L 6种MALs的提取离子色谱图见图1。图110 μg/L 6种MALs的提取离子色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.023.F1a1（a）红霉素10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.023.F1a2（b）罗红霉素10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.023.F1a3（c）竹桃霉素10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.023.F1a4（d）泰乐菌素10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.023.F1a5（e）替米考星10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.023.F1a6（f）交沙霉素由图1可知，6种MALs在色谱柱上保留良好，保留时间内无杂峰干扰。2.5配合饲料中大环内酯类药物回收率（见表5）由表5可知，配合饲料中MALs在10~100 μg/kg添加水平下的平均回收率为72.7%~95.0%，RSD为1.3%~9.5%，回收率及重复性满足检测要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.023.T005表5配合饲料中大环内酯类药物回收率项目10 μg/kg50 μg/kg100 μg/kg回收率RSD回收率RSD回收率RSD红霉素88.36.376.88.575.31.6罗红霉素83.39.580.38.574.72.3竹桃霉素89.36.178.29.086.91.3泰乐霉素72.77.575.28.075.04.4替米考星88.74.289.05.784.32.6交沙霉素95.07.586.85.481.02.3%3结论本试验建立测定配合饲料中6种MALs的残留量的方法，回收率为72.7%~95.0%，RSD为1.3%~9.5%，定量限为10 μg/kg。该方法前处理过程简单、涉及的仪器设备和试剂数量减少、操作简便快捷、安全性高，具有选择性好、灵敏度高、结果准确的特点，可以为配合饲料中大环内酯类药物的检测提供依据。