牦牛是高海拔地区的特有牛种，在我国主要分布在青藏高原[1-3]。传统的牦牛养殖主要以放牧为主。牦牛犊牛出生后采食的母乳较少，得不到充足的营养，导致消化器官发育缓慢，免疫力低下，到冷季时受到寒冷应激，易引发消化道和呼吸道疾病，死亡率较高[4]。生长阶段的牦牛处于育肥饲养的重要时期，冬季牧草缺乏不能满足生长牦牛自身的生长发育，导致体重降低[5]。因此，保障牦牛犊牛安全度过冷季及生长牦牛在冷季的正常生长发育是亟待解决的问题。研究表明，冷季补饲措施有利于牦牛的生长发育。吴华卓等[6]发现，在冷季对各年龄段的牦牛补饲精料可以显著提高牦牛的总增重和日增重，有利于冷季保膘。戴东文等[7]发现，对2.5岁牦牛补饲精料可以显著提高牦牛日增重和养殖效益。补饲精料是提高牦牛生长性能的有效措施之一，可以减轻草地压力[8]。目前，关于冷季补饲精料多是对体重、血液指标影响的研究，对肠道细菌研究较少。肠道内的微生物相当于动物机体的第二套基因组，发挥着营养、代谢和保护作用，易受日粮的影响[9]。因此，本试验研究牦牛肠道细菌区系以探究补饲精料影响冷季放牧牦牛生长发育的内部机制，为牦牛合理补饲精料提供参考。1材料与方法1.1试验地概况试验地位于东经96°53'和北纬34°56'范围内的青海省玉树州歇武镇，平均海拔4 500 m，年平均温度-1.6 ℃。草地类型为高寒草甸，草原冷季长达8个月，牧草5月份开始返青。1.2试验设计试验时间为2019年12月27日~2020年5月14日。在青海省玉树州歇武镇的同一牧场中选择0.5岁的公牦牛，放牧组6头牦牛自由放牧，补饲组6头牦牛自由放牧，每天补饲0.5 kg的育肥犊牛精料。选择2.5岁的公牦牛，放牧组6头牦牛自由放牧，补饲组6头牦牛自由放牧，每天补饲1.5 kg的育肥牦牛精料。试验牦牛每天8：00出牧，18：00归牧，归牧后补饲精料。精料购自青海河湟青牧饲料科技开发有限公司。1.3样品采集在正式试验开始前（2019年12月26日）及试验结束后（2020年5月15日）采集每头试验牦牛的直肠粪便放入已灭菌的3个5 mL冻存管中，立即投入液氮罐中保存，备用。0.5岁牦牛因外部因素有的死亡，故采集的样品数减少。0.5岁牦牛放牧组试验前和试验后分别记为Ad和Am，补饲组分别记为Td和Tm。2.5岁牦牛放牧组试验前和试验后分别记为Cd和Cm，补饲组分别记为Sd和Sm。采集补饲的育肥犊牛精料和育肥牦牛精料。将样品送至青海省牦牛工程技术研究中心实验室进行营养成分分析。育肥犊牛和育肥牦牛精料营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.T001表1育肥犊牛和育肥牦牛精料营养水平（干物质基础）项目育肥犊牛育肥牦牛总能/(MJ/kg)16.4716.65粗蛋白/%15.5614.78粗脂肪/%3.124.70中性洗涤纤维/%14.1916.03酸性洗涤纤维/%8.517.83钙/%0.560.80磷/%1.490.45注：营养水平均为实测值。1.416S rRNA测序分析将直肠粪样的总基因组DNA使用磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）进行提取。使用通用引物V338F（5'-ACTCCTAGGGGGCAGCAG-3'）和V806R（5'-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3'）对微生物基因组总DNA的16S rRNA V3-V4高变区进行PCR扩增。使用TruSeq DNA PCR-Free Libraray Preparation Kit建库试剂盒（Illumina）进行文库构建，并经过Qubit和Q-PCR定量和检验合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。测序数据去除无用序列得到最终有效序列（Effective Tags）。利用Uparse软件（Uparse v7）对所有样本的全部有效序列进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单元（OTUs），并筛选代表序列。采用Mothur方法与SILVA132的SSUrRNA数据库进行物种注释分析，并统计在门和属水平上的群落组成。对各样本的数据进行均一化处理，使用Qiime软件（Version 1.9.1）和R软件（Version 2.15.3）进行多样性分析，最后进行Tax4Fun功能预测，得到功能注释信息。1.5数据统计与分析数据采用SPSS 20.0软件进行ANOVA单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较检验，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1牦牛肠道细菌区系测序结果和Alpha多样性分析（见表2、表3）由表2、表3可知，测序深度已经接近饱和状态，说明测序结果可以代表样品中微生物的真实信息；Cm的OTUs、ACE指数、Chao1指数显著大于Cd、Sd和Sm（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.T002表20.5岁牦牛肠道细菌区系测序结果和Alpha多样性分析项目AdTdAmTm有效序列41 816.40±4 107.38b48 973.50±5 641.25b58 430.00±6 373.81a60 347.25±6 947.49aOTUs1 174.40±38.75b1 167.50±116.87b1 983.75±49.11a2 119.25±573.66a覆盖指数0.99±00.99±00.99±00.98±0.01ACE指数1 211.00±137.88b1 170.50±102.95b2 205.30±170.46a2 376.59±731.56aChao1指数1 302.75±374.22b1 155.79±109.05b2 174.35±192.30a2 402.62±731.95aShannon指数7.73±0.14b7.44±0.52b8.40±0.12a8.43±0.39aSimpson指数0.98±0ab0.98±0.01b0.99±0a0.99±0a注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.T003表32.5岁牦牛肠道细菌区系测序结果和Alpha多样性分析项目CdSdCmSm有效序列47 769.33±7 413.0455 287.50±6 125.2056 147.00±5 309.4554 841.00±2 838.57OTUs1 272.67±92.62c1 303.67±59.91bc1 883.67±158.65a1 530.67±332.51b覆盖指数0.99±00.99±00.99±00.99±0ACE指数1 264.81±114.49c1 309.04±77.52c1 975.55±208.06a1 612.50±374.59bChao1指数1 260.40±129.58c1 304.74±99.14c1 943.50±240.81a1 643.84±378.51bShannon指数7.89±0.25b8.18±0.15ab8.35±0.35a8.20±0.35abSimpson指数0.98±0b0.99±0a0.99±0a0.99±0a2.2Beta多样性分析（见图1、图2、表4）由图1可知，0.5岁牦牛肠道细菌区系的主坐标（PCoA）中PC1和PC2这2个主成分分别占总差异的34.94%和15.74%，Am和Tm明显分离。由表4可知，Ad和Am、Td和Tm、Am和Tm之间具有显著差异（P0.05）。由图2可知，2.5岁牦牛肠道细菌区系的主坐标（PCoA）中PC1和PC2两个主成分分别占总差异的18.42%和14.38%，Cm和Cd、Sd、Sm明显分离。MRPP组间差异分析发现，Cd和Cm、Sd和Sm、Cm和Sm之间具有显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.F001图10.5岁牦牛肠道细菌区系基于Unweighted Unifrac距离的PCoA分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.T004表4MRPP组间差异分析项目Ad-AmTd-TmAm-TmCd-CmSd-SmCm-SmA值0.150.070.090.120.130.07观测值0.260.430.410.270.290.31期望值0.300.460.450.310.330.33P值0.010.010.020.000.000.0010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.F002图22.5岁牦牛肠道细菌区系基于Unweighted Unifrac距离的PCoA分析2.3冷季补饲对牦牛肠道细菌区系组成的影响2.3.1牦牛肠道细菌区系在门水平上的组成分析（见表5、表6）由表5、表6可知，0.5岁和2.5岁牦牛肠道细菌区系优势菌门有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）。Tm的变形菌门和放线菌门（Actinobacteria）相对丰度显著高于Am、Td和Ad（P0.05）。Sm的变形菌门相对丰度显著高于Sd、Cd和Cm（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.T005表50.5岁牦牛肠道细菌区系在门水平上的组成分析项目AdTdAmTm厚壁菌门67.98±3.01a54.93±8.69c64.74±4.37ab56.93±5.54bc拟杆菌门27.92±2.97b39.02±8.55a28.44±3.67b31.10±4.68ab变形菌门0.51±0.06c0.56±0.19c2.32±0.29b3.88±2.42a疣微菌门1.78±2.541.59±1.710.41±0.382.16±1.81放线菌门0.06±0.03c0.02±0.02c0.44±0.10b1.41±0.42a%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.T006表62.5岁牦牛肠道细菌区系在门水平上的组成分析项目CdSdCmSm厚壁菌门56.88±2.6961.66±4.1160.47±3.1058.26±3.12拟杆菌门38.62±3.61a33.18±2.82b35.75±2.03ab35.91±2.03ab变形菌门0.65±0.25b1.06±0.32b0.85±0.33b2.25±1.25a疣微菌门1.06±0.09b1.26±0.35ab2.20±0.79a2.37±0.58a%2.3.2牦牛肠道细菌区系在属水平上的组成分析（见表7、表8）由表7可知，0.5岁牦牛肠道细菌区系优势菌属为另枝菌属（Alistipes）、拟杆菌属（Bacteroides）、艾克曼菌属（Akkermansia）、纤维杆菌属（Fibrobacter）和未分类的瘤胃菌（unidentified_Ruminococcaceae）；Tm的拟杆菌属、艾克曼菌属和Subdoligranulum相对丰度显著高于Am（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.T007表70.5岁牦牛肠道细菌区系在属水平上的组成分析项目AdTdAmTm另枝菌属2.73±0.663.11±0.775.48±2.273.86±2.53拟杆菌属4.93±0.69a4.55±1.11a2.86±0.44b5.90±1.42a艾克曼菌属0.65±0.49b0.52±0.44b0.57±0.46b1.87±0.55a纤维杆菌属0.01±0.020.87±1.840.06±0.090.07±0.08未分类的瘤胃菌1.10±0.14b1.07±0.29b1.74±0.27ab2.18±1.20aSubdoligranulum0±0b0±0b0±0b1.37±1.92a%由表8可知，2.5岁牦牛肠道细菌区系优势菌属为另枝菌属、拟杆菌属、Alloprevotella、艾克曼菌属、罗姆布茨菌属（Romboutsia）和未分类的瘤胃菌；Sm的另枝菌属相对丰度显著低于Cm（P0.05），Sm的拟杆菌属相对丰度显著高于Cm（P0.05），Sm的艾克曼菌属相对丰度显著高于Sd、Cd和Cm（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.T008表82.5岁牦牛肠道细菌区系在属水平上的组成分析项目CdSdCmSm另枝菌属2.77±0.71b4.12±1.10b5.02±2.31a2.79±0.61b拟杆菌属4.18±0.52b4.70±0.41b3.38±0.57c5.07±0.88abAlloprevotella1.47±0.751.03±0.541.22±0.970.96±0.33艾克曼菌属0.52±0.44b0.77±0.57b1.20±0.99b2.10±0.77a罗姆布茨菌属1.38±0.84a1.23±0.91a0.19±0.06b0.32±0.08b未分类的瘤胃菌1.29±0.20c1.49±0.15bc1.90±0.35a1.68±0.24ab%2.4肠道细菌区系功能预测（见图3~图6）由图3可知，0.5岁补饲牦牛试验前后只有6个功能相对丰度有显著差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.F003图30.5岁补饲牦牛试验前后肠道细菌区系功能差异分析由图4可知，Tm的翻译（translation）、核苷酸代谢（nucleotide metabolism）、辅助因子和维生素的代谢（metabolism of cofactors and vitamins）等功能相对丰度显著高于Am（P0.05），而信号转导（signal transduction）、细胞运动（cell motility）、酶家族（enzyme families）等功能相对丰度显著低于Am（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.F004图4补饲精料对0.5岁牦牛肠道细菌区系功能相对丰度的影响由图5可知，2.5岁补饲牦牛试验前后只有7个功能相对丰度具有显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.F005图52.5岁补饲牦牛试验前后肠道细菌区系功能差异分析由图6可知，Sm的翻译、能量代谢（energy metabolism）、辅助因子和维生素的代谢等功能相对丰度显著高于Cm（P0.05），而转录（transcription）、遗传信息处理（genetic information processing）、癌症（cancers）等功能相对丰度显著低于Cm（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.015.F006图6补饲精料对2.5岁牦牛肠道细菌区系功能相对丰度的影响3讨论3.1补饲精料对冷季放牧的0.5岁牦牛肠道细菌区系的影响反刍动物肠道中的细菌会参与调节宿主的新陈代谢，促进宿主对营养物质的吸收利用[10]，并且与宿主肠道黏膜免疫系统相互协助维护机体健康[11]。日粮是影响动物肠道细菌区系的主要因素之一[12]。本试验中，补饲组和放牧组0.5岁牦牛肠道细菌区系在PCoA分析中相互分离，具有显著性差异。魏子维等[13]发现，饲喂高水平和低水平精料的雷州山羊肠道细菌区系在PCoA分析中相互分离，说明补饲精料会影响肠道细菌区系结构。进一步分析发现，0.5岁补饲组牦牛肠道变形菌门相对丰度显著高于放牧组。变形菌门是细菌中最大的一门，虽然包括一些机会病原菌，但大多数变形菌门不是致病菌，可以对蛋白质和碳水化合物进行代谢，对于维持肠道的厌氧环境起着重要作用[14]。在功能预测中发现，试验后补饲组牦牛的翻译、核苷酸代谢、辅助因子和维生素的代谢、萜类和聚酮类化合物的代谢等相对丰度显著高于试验后放牧组，说明补饲精料给予肠道细菌更多的底物，提供更多的能量，促使其发挥代谢功能。放线菌门在维持肠道稳态方面起着关键作用，尤其是放线菌门中双歧杆菌被广泛用作益生菌制剂[15]。放线菌门只在补饲组牦牛中的相对丰度超过1%，说明补饲精料可以改善肠道健康。在属水平上，补饲组牦牛的拟杆菌属相对丰度显著高于放牧组，拟杆菌属有助于免疫T细胞功能完善，减少肠道中的脂多糖，可以抑制促炎反应[16]。补饲组牦牛的艾克曼菌属相对丰度显著高于放牧组和试验前牦牛，艾克曼菌属属于疣微菌门，占疣微菌门数量的80%以上，其代谢产物丙酸通过G蛋白偶联受体参与机体免疫调节，促进肠黏膜中的免疫稳态[17]。张晨[18]对犊牛补饲精料，发现补饲组艾克曼菌属相对丰度较放牧组高，与本试验结果一致。Subdoligranulum具有代谢碳水化合物、参与短链脂肪酸合成的功能[19]。短链脂肪酸可以促进黏蛋白的分泌，从而抵抗致病菌在肠道黏膜上定植[20]。本试验中，补饲组牦牛中的Subdoligranulum相对丰度最高，以上说明冷季补饲精料可以提高牦牛犊牛的免疫能力。3.2补饲精料对冷季放牧的2.5岁牦牛肠道细菌区系的影响不同时期动物体生长发育会有所差异，幼年时期以头、骨骼和四肢发育为主，青年时期以体长和肌肉发育为主，成年后以脂肪发育为主[21]。肠道细菌及其代谢物会影响肌肉的生长和发育[22-23]。付洋洋[24]研究发现，2.5岁牦牛与1.5岁、4.5岁牦牛相比生产性能最高，肉品质较好。因此，本试验在冷季给2.5岁牦牛补饲精料，以提供足够的营养维持肠道细菌区系正常发挥作用，改善生产性能。在Alpha多样性分析中发现，放牧组牦牛的OTUs、ACE指数和Chao1指数显著高于补饲组牦牛，说明放牧组牦牛肠道细菌较补饲组丰富。周力等[25]对藏羊补饲精料，发现对照组ACE指数和Chao1指数显著高于试验组，与本研究结果相似。原因是补饲精料后非结构性碳水化合物会增加，在肠道细菌作用下产生较多短链脂肪酸会抑制酸敏感菌的活性[26]。Beta多样性分析中发现，补饲组和放牧组牦牛肠道细菌区系结构具有显著性差异，在门水平上发现补饲组牦牛变形菌门相对丰度显著高于放牧组。王柏辉[27]发现，舍饲组苏尼特羊肠道中变形菌门的相对丰度高于放牧组，并且舍饲组肌内脂肪沉积较好、肌肉组织更健康，说明补饲精料可能利于产出品质较高的牦牛肉。在属水平上，补饲组牦牛的另枝菌属相对丰度显著低于放牧组，与试验前无显著差异。李素彦[28]研究发现，宿主炎症反应失衡造成器官功能障碍时，另枝菌属的相对丰度显著升高，并且补饲组牦牛拟杆菌属和艾克曼菌属相对丰度显著高于放牧组牦牛，说明补饲精料可能提高了牦牛的免疫功能，而未补饲牦牛在冷季可能处于亚健康状态。艾克曼菌属是产丙酸菌，罗姆布茨菌属是产丁酸菌[29-30]。景小平[31]在冷季对藏绵羊每天补饲200 g精料，微生物发酵类型由乙酸型转变为丙酸型。本研究中，经历冷季的补饲组牦牛和放牧组牦牛肠道中罗姆布茨菌属相对丰度与试验前相比均降低，说明补饲精料后主要是增加丙酸的代谢来提供更多的能量。在功能预测中补饲组牦牛能量代谢及其他代谢相对丰度显著高于放牧组牦牛，进一步说明补饲精料调节了牦牛能量代谢类型。4结论补饲精料的冷季放牧牦牛肠道细菌区系变化有利于肠道发挥消化、代谢及免疫功能。