蛋白酶是可以将蛋白质肽链转化成游离氨基酸的一类酶[1]。蛋白酶最早应用于工业中生产酶制剂，占整个酶制剂市场的60%[2]。在众多蛋白酶中，中性蛋白酶因其作用条件温和，能水解各种蛋白质，在食品、饲料、皮革和环境等行业应用广泛[3-4]。添加中性蛋白酶能减少饲料中抗营养因子对畜禽的不良影响[5]。水产动物的肠道接近中性，中性蛋白酶能够更好地被利用，因此在水产动物饲料中添加中性蛋白酶能够提高其消化吸收能力[6]。蛋白酶可以从植物组织中提取，也可以在微生物中获得。生产酶制剂的微生物主要为芽孢杆菌。芽孢杆菌生长繁殖迅速，产生的蛋白酶大多在细胞外作用，提取和纯化步骤比较简便，更适用于企业大规模生产。产蛋白酶的菌株多分离自含氮丰富的物质，如污水处理厂的污泥[7]、动物肠道[8]、豆瓣酱[9]等，分离自腐烂水果中的解蛋白芽孢杆菌文献鲜有报道。目前，国内外学者主要利用基因工程对芽孢杆菌所产生的酶进行其序列测定，分析其内部结构以及所具备的功能和表达调配控制[10]，使酶适应不同需要，提高酶活力。本试验对分离自腐烂鹰嘴桃的菌株C进行生长特征观察、染色镜检、生化鉴定和16S rDNA序列测定，并对其进行酶学特性研究，以期为工业酶制剂的发展和生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌株从腐烂鹰嘴桃上分离的1株菌株C。1.1.2试剂革兰氏染液、变形杆菌成套生化鉴定管、福林-酚试剂、Kovacs氏靛基质试剂、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、甘油、硝酸盐还原试剂盒、M-R试剂盒、V-P试剂盒，均购自青岛海博生物技术有限公司。1.1.3培养基酪蛋白固体培养基：营养肉汤培养基（NA）+20 g/L酪蛋白，121 ℃灭菌15 min。酪蛋白液体培养基：营养肉汤培养基（NB）+20 g/L酪蛋白，121 ℃灭菌15 min。1.2试验方法1.2.1菌株鉴定1.2.1.1生长特征观察及染色菌株在固体平板培养基上培养24 h，观察并记录菌落形状体态、透明程度、突起程度、边缘和表面情况、颜色、是否容易被挑起等特征。1.2.1.2生化试验参照东秀珠等[11]编制的手册，对菌株C进行革兰氏染色、西蒙式枸橼酸盐、色氨酸肉汤、明胶液化、鸟氨酸脱羧酶肉汤、尿素酶、糖醇、脂酶、水杨苷、七叶苷水解、Kovacs氏靛基质、硝酸盐还原、M-R、V-P、过氧化氢酶、淀粉水解等试验。1.2.1.316S rDNA测序取1 mL种子培养液，接种至100 mL NB培养基，37 ℃、160 r/min摇床培养24 h，转移至50 mL离心管中，3 000 r/min离心10 min，弃去上层液体，将沉淀物送至广东南芯医疗科技有限公司测序。在NCBI数据库BLAST所得到的菌株C的16S rDNA序列，从而获得与该菌株序列同源性高的已知序列。在MEGA 7.0软件中创建菌株C的系统发育树，分析受检菌株C与已知菌株的关系。1.2.2制作生长曲线[12]将种子培养液（接种量为5%）移至培养基中作为试验测试液，37 ℃、160 r/min摇床培养，每隔2 h取1次试样测定吸光值，重复3次，测至菌株的吸光度下降即衰亡期出现。根据培养菌液的时间和所测吸光值制作菌株C的生长曲线。1.2.3蛋白酶学特性研究1.2.3.1产蛋白酶试验采用滤纸片法以酪蛋白为底物检测菌株C是否产蛋白酶。将种子培养液（接种量为5%）移入NB中，37 ℃、160 r/min摇床培养8 h，即为试验粗酶液。将直径6 mm的灭菌滤纸圆片置于粗酶液中浸泡5 min，达到菌液数量一致，利用灭菌镊子夹起均匀分布于酪蛋白平板中三处，呈三角形，37℃培养24 h，观察滤纸片边沿是否出现一环透明圈，使用直尺测量其直径并记录，重复3次。1.2.3.2制作酪氨酸标准曲线酪氨酸标准曲线参考文献[13]的方法制作。1.2.3.3制备粗酶液参考周绍琴等[14]的方法并作出改进。将种子培养液（接种量为5%）移入酪蛋白液体培养基中，37 ℃、160 r/min摇床培养48 h，10 000 r/min离心30 min，取上层澄清液体作为待检测的粗酶液。1.2.3.4福林酚法测蛋白酶活力[15]菌株产生的蛋白酶作用于酪蛋白，将酪蛋白转化为酪氨酸，通过酪氨酸的生成量即可获得蛋白酶的活力。试验具体步骤见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.F001图1福林酚法试验流程图菌株C产生的蛋白酶活力单位U[14]定义：37 ℃条件下，1 mL粗酶液1 min分解酪蛋白为1 μg酪氨酸所消耗的蛋白酶数量。计算其蛋白酶活力（U）。U=A1-A2×K×V×1t (1)式中：K为通过酪氨酸标准曲线测得的吸光常数；A1为试验组吸光度值；A2为对照组吸光度值；1为稀释倍数；V为反应试剂总体积；t为反应时间。1.2.3.5影响蛋白酶活力的因素pH值：使用pH值6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液制作酪蛋白溶液（浓度为2%），按照福林酚法测定菌株C的粗酶液在不同pH值下的蛋白酶活力，确定菌株C所产蛋白酶的最适pH值，以测得的最大蛋白酶活力为100%，计算相对酶活，制作菌株C在不同pH值下的相对酶活曲线。温度：将使用最适pH值缓冲液制作的酪蛋白溶液（浓度为2%）与酶液混合，分别迅速置于30、40、50、60、70、80 ℃水浴中反应10 min，按照福林酚法测定菌株C的粗酶液在30~80 ℃下的酶活力，确定菌株C所产蛋白酶的最适反应温度，以测得的最大蛋白酶活力为100%，计算相对酶活，制作菌株C在不同反应温度下的相对酶活曲线。热稳定性：将分别在30、40、50、60、70、80 ℃水浴30 min的1 mL粗酶液与制作好的酪蛋白溶液（浓度为2%）混合，在最适pH值和反应温度下充分反应，按照福林酚法测定菌株C的粗酶液在上述温度下的蛋白酶活力，以预热2 min的粗酶液的蛋白酶活力为100%，计算相对酶活，制作菌株C在不同反应温度下的相对酶活曲线。金属离子：在1 mL粗酶液中分别加入1 mL 1 mmol/L的Fe2＋、Mg2＋、K＋、Cu2＋、Ca2＋和EDTA溶液，按照福林酚法测定菌株C的粗酶液在不同金属离子溶液下的蛋白酶活力，反应试剂体积为5 mL，以不加任何金属离子的粗酶液的蛋白酶活力为100%，计算相对酶活。2结果与分析2.1菌株鉴定2.1.1菌株C的生长特征观察及染色（见图2）由图2可知，在NA培养24 h，菌株C颜色为米白色，不透光，多为圆形，边缘比较规整，表面光亮未出现褶皱，湿润，容易被接种环挑起。菌株C经革兰氏染色后，在油镜下观察颜色和状态，结果表明，该菌株为革兰氏阳性细菌。图2菌株C菌落形态和显微镜观察10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.F2a1（a）菌落形态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.F2a2（b）油镜观察（×1 000）2.1.2菌株C的生化特征（见表1）为避免存在假阳性，对菌株C进行生化试验。由表1可知，菌株C的过氧化氢酶、硝酸盐还原、明胶液化、麦芽糖、淀粉水解等试验呈阳性，西蒙氏柠檬酸盐、吲哚等试验呈阴性。参照东秀珠等[11]编制的手册，菌株C生化特征与对芽孢杆菌属的描述基本一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.T001表1菌株C的生化特征生化特征结果生化特征结果西蒙式枸橼盐-葡萄糖+吲哚试验-山梨醇-明胶液化+蔗糖-鸟氨酸脱羧酶肉汤-甘油-尿素酶+硝酸盐还原+木糖-M-R+麦芽糖+V-P+脂酶-过氧化氢酶+甘露醇-淀粉水解+水杨苷+卵黄试验+七叶苷水解+注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。2.1.316S rDNA测序结果（见图3）将菌株C送至广东南芯医疗科技有限公司进行测序，测得16S rDNA序列为1 396 bp，登录NCBI网站，将得到的16S rDNA序列在核酸数据库中BLAST，剔除与受检菌株已知同源性低的序列，取同源性高的序列用MEGA 7.0软件构建系统发育树。由图3可知，在BLAST得到的同源性最高的序列的菌株中，菌株C与维德曼芽孢杆菌（Bacillus wiedmannii）、解蛋白芽孢杆菌（Bacillus proteolyticus）亲缘关系最近，处于同支，序列同源性均为99.93%。经广东南芯医疗科技有限公司对菌株C测序，菌株C所测得的16S区与维德曼芽孢杆菌、解蛋白芽孢杆菌的序列相似性最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.F003图3基于16S rDNA序列的系统发育树Rachel等[16]在牛乳发现，维德曼芽孢杆菌生化中葡萄糖反应为阴性，与本试验菌株C生化结果不一致，因此排除维德曼芽孢杆菌，初步鉴定菌株C为解蛋白芽孢杆菌。2.1.4菌株C的生长曲线（见图4）由图4可知，菌株C经过2 h的滞后期后进入对数期，生长量开始逐渐上升；10 h时上升幅度减缓，但仍保持上升趋势；26~46 h生长趋于平稳状态，为稳定期；48 h时曲线开始下滑，菌繁殖速度受到限制，生长繁殖数量不断减少，进入衰亡期。菌株在8 h处于对数期，活力好。因此，以下试验涉及菌液培养时，培养时间为8 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.F004图4菌株C的生长曲线2.2菌株C的蛋白酶学特性研究2.2.1菌株C的产蛋白酶试验（见表2）以酪蛋白固体培养基中是否存在透明圈作为解蛋白芽孢杆菌能否产蛋白酶的依据。两瓶试验粗酶液，每瓶浸泡9个滤纸片，共有6个平皿18个滤纸片。由表2可知，大部分滤纸片周围均有一圈透明圈，结果表明，解蛋白芽孢杆菌能够产生蛋白酶分解蛋白质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.T002表2透明圈直径试验平皿1平皿2平皿318.17±0.738.17±0.738.00±0.5828.00±1.008.17±0.738.33±0.44mm2.2.2L-酪氨酸的标准曲线（见图5）以L-酪氨酸浓度为横坐标，A660 nm值为纵坐标制作L-酪氨酸标准曲线。由图5可知，L-酪氨酸标准曲线的方程为y=0.009 3x+0.005 6，相关系数R2为0.999 4，表明L-酪氨酸浓度与波长660 nm下的吸光度之间的线性关系良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.F005图5酪氨酸的标准曲线2.2.3菌株C的蛋白酶活力测定结果（见表3）由表3可知，菌株C在不同培养条件下，酶活表现不一致，在普通培养基中不分泌蛋白酶，在含酪蛋白的培养条件下分泌蛋白酶，活力为13.400 U/mL。周绍琴等[14]在传统豆瓣酱分离得3株高产蛋白酶的芽孢杆菌，其蛋白酶活力分别为137.04、165.56、103.29 U/mL，均高于100 U/mL。肖怀秋等[17]在土壤里分离得1株产中性蛋白酶芽孢杆菌，在氮源和碳源分别是豆饼粉和玉米粉的条件下，其蛋白酶活力分别是452.96和368.72 U/mL。研究表明，本试验菌株C产蛋白酶的能力不高，活力较低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.T003表3菌株C的蛋白酶活力测定结果组别吸光值平均吸光值酶活/(U/mL)1号管2号管3号管NB（对照组）0.2470.2480.2470.2470NB+菌株C（试验组）0.2480.2460.2460.247酪蛋白（对照组）0.2370.2370.2370.23713.400±0.014酪蛋白+菌株C（试验组）0.5500.5510.5510.551菌株C产蛋白酶能力弱可能由以下原因造成：一是菌种，菌株C分离自腐败鹰嘴桃，鹰嘴桃的蛋白结构与酪蛋白的结构存在差异；二是试验方法的差异。乐意[18]使用透析袋将酶液浓缩，比本试验单纯离心效果好。另外，粗酶液的培养基配方以及接种量不同等均会影响菌株产生蛋白酶的能力。2.2.4影响蛋白酶活力的因素2.2.4.1pH值对蛋白酶活力的影响（见图6）大多芽孢杆菌产的酶为中性或碱性[19-20]。本试验的酪蛋白在pH值4.6时会发生沉淀，在pH值5.0时会出现一小部分不溶性固体，选择pH值6.0~10.0研究其对菌株C产的蛋白酶活力的影响。由图6可知，pH值7.0时粗酶液的蛋白酶活力最高，是最适反应pH值，说明此蛋白酶为中性蛋白酶。随着pH值增大，蛋白酶活力逐渐减弱，pH值为10.0时相对酶活为91.3%，仍处于高水平。研究表明，该蛋白酶适合在中性或偏碱性环境中发挥作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.F006图6pH值对蛋白酶酶活力的影响2.2.4.2反应温度对蛋白酶活力的影响（见图7）由图7可知，随着温度升高，粗酶液中的蛋白酶活力不断下降，30 ℃时蛋白酶活力最高。该解蛋白芽孢杆菌产生的蛋白酶在30~80℃温度范围内的最适反应温度为30 ℃，与权淑静等[21]试验结果相似。温度升高并未导致酶活力大幅度下降，说明该酶对温度要求不苛刻，可以适应工业环境生产。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.F007图7反应温度对酶活力的影响2.2.4.3热稳定性对蛋白酶活力的影响（见图8）由图8可知，30~80 ℃时，相对酶活均高于97%，研究表明，该蛋白酶具有良好抗热性。孙晓玲[22]从土壤分离的1株菌株分泌的高温蛋白酶在80 ℃时酶活基本丧失，本试验菌株C产生的蛋白酶在70、80 ℃下仍保持着较高的酶活，比高温蛋白酶耐热性强，与一般酶的酶活不同，可能由芽孢的耐热特性所致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.F008图8温度对酶稳定性的影响2.2.4.4金属离子对蛋白酶活力的影响（见图9）由图9可知，所有金属离子作用粗酶液的相对酶活均在80%以上，均对该蛋白酶存在抑制作用，但抑制效果不明显，其中抑制效果较强烈的为Cu2＋，其次是Fe2＋。卫春会等[23]在高温大曲分离的产蛋白酶菌株，外加硫酸铁能够促进其酶活。Mg2+对于大部分菌株所产的中性蛋白酶起激活作用，激活机理主要为Mg2+置换中性金属蛋白酶活性部位的部分Zn2+，改变蛋白酶活性位点微环境[24]；在中性蛋白酶酶学性质的相关研究中，Ca2+一般表现为明显激活作用[25]。本试验中，未出现促进该蛋白酶酶活的金属离子，有待进一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.018.F009图9金属离子对酶活力的影响微生物中性蛋白酶大部分属于金属蛋白酶，且菌株C产生的蛋白酶被EDTA抑制，属于金属蛋白酶。中性金属蛋白酶对疏水氨基酸有反应[26]，专一性强，酪蛋白未被其充分利用，是导致菌株C产生的蛋白酶其活力不高的原因之一。3讨论国内外关于解蛋白芽孢杆菌应用研究的报道甚少，解蛋白芽孢杆菌CFR3001是1株从鱼类加工废料中分离的产碱性蛋白酶的细菌，因其蛋白水解活性和对几种病原体的拮抗作用，在水产养殖中有作为生物修复和益生菌剂的潜力[27]。芽孢杆菌在工业上是重要的产生菌，具有很强的产酶能力，其中研究较多的是产蛋白酶和淀粉酶能力较强的枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。抗生素减停给养殖业带来持续挑战，用微生物替代抗生素能提高饲料的利用率，加快动物向成熟阶段发展，降低抗生素对动物的损伤。饲料中添加枯草芽孢杆菌能调够节动物体内微生态平衡并促进动物消化吸收[28]。Chen等[29]研究表明，在鸡饲料中添加一定量的纳豆芽孢杆菌，发现其体内的酶活力增加，加快了鸡对饲料中营养物质的消化和吸收。本试验中，菌株C的16S rDNA序列全长为1 396 bp，参考菌种鉴定和生化鉴定结果，初步鉴定为解蛋白芽孢杆菌。该解蛋白芽孢杆菌从腐烂鹰嘴桃中分离所得，是1株致病菌。该菌是否能够加入食品中，需要在饲料中添加合适菌量喂养动物进行毒性试验等试验，确保不会影响人体生殖系统。中性蛋白酶可以添加到肉类中改善其内部结构，达到嫩化的目的；也可以应用于各种酒类、酱油酿造，饮料的澄清以及烘焙食品中。将中性蛋白酶加入饲料中能够帮助动物提高日粮的消化利用，间接去除饲料中的抗营养因子，提高营养成分的消化率[30]。肉鸡日粮中添加不同菌种来源的蛋白酶能够显著降低料重比，显著提高回肠末端氨基酸的表观消化率[31]。本试验中，解蛋白芽孢杆菌所产的酶是中性蛋白酶，酶活在高pH值以及多种金属离子受抑制程度低，具有良好的潜在应用价值。该酶活力不高，但可通过优化发酵条件来提高酶活力，也可以将该酶与其他酶进行组合制成酶制剂，高效配制更好发挥其价值，加强其在各环境中的稳定性。4结论分离自腐烂鹰嘴桃的菌株C具备分泌蛋白酶的能力，该菌株所产蛋白酶的活力为13.40 U/mL。该菌株产蛋白酶的最适pH值为7.0，最适反应温度为30 ℃，属于中性、低温蛋白酶，80 ℃水浴中保持30 min后仍保持97%以上的相对酶活，具有良好抗热性，金属离子Cu2＋对该蛋白酶的抑制效果最为明显，其次是Fe2＋。