在传统代谢模型中，蛋白质必须经过消化分解为游离的氨基酸，才能够被机体吸收和利用。在动物肠道中，蛋白质经消化分解的产物并非游离氨基酸，主要为小肽。与氨基酸相比，小肽更易被机体吸收和利用。机体消化时所形成寡肽的数量、比例等均与日粮的蛋白质含量密切相关[1]。哺乳动物中的POTs家族有4个成员，分别为PepT1、PHT1、PepT2和PHT2。马的肠道是消化和吸收蛋白质的主要场所，蛋白质经过胃部，在肽酶等的作用下被消化、分解为寡肽和氨基酸，再由转运蛋白进行转运，以便机体吸收利用。有报道显示，以不同精粗比但粗蛋白含量相同的日粮饲喂马匹时，随着粗饲料水平的提高，乳蛋白率不断下降[2]。本试验研究日粮不同精粗比对马肠道小肽转运蛋白mRNA表达的影响，为马养殖业提供参考。1材料与方法1.1试验设计选取（102±4）日龄、体重（120.14±4.06）kg的6匹马，随机分为2个处理，每个处理3个重复。试验于2019年4月~2019年5月在扬州大学实验农牧场进行研究。试验马分别饲喂精粗比为75∶25（处理Ⅰ）和65∶35（处理Ⅱ）的颗粒料。预试期14 d，正式试验期56 d。依据NRC（2001）中所规定的营养需要配置各处理马的颗粒料。为确保两组日粮的颗粒料营养水平相同，对精料中豆粕、玉米、麦麸、DDGS（干酒糟及其可溶物）进行调整，同时合理调整粗料中各组成含量，以促使颗粒料配制出不同精粗比。粗饲料中小黑麦草与苜蓿含量比为1∶3。所有原料粉碎后，在扬州大学实验农牧场采取20型颗粒料机组制成。依据《饲料分析及饲料质量检测技术》测定颗粒料营养水平。颗粒料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.013.T001表1颗粒料组成及营养水平原料组成/%处理Ⅰ处理Ⅱ营养水平处理Ⅰ处理Ⅱ合计100.00100.00豆粕12.0011.28泌乳净能/(MJ/kg)6.496.36玉米35.4232.39粗灰分/%4.224.31食盐00.09干物质/%84.5085.05干酒糟及其可溶物3.404.80粗脂肪/%3.673.58小黑麦草6.258.75粗蛋白质/%17.6117.36麦麸21.0013.50中性洗涤纤维/%28.9434.72苜蓿18.7526.25酸性洗涤纤维/%13.3815.41磷酸氢钙00.17蛋氨酸/%0.260.26碳酸钙0.400.03赖氨酸/%0.730.73小苏打0.250.22磷/%0.400.40预混料2.502.50钙/%0.580.58蛋氨酸0.030.02注：1.预混料购自北京泽牧久远生物科技研究院。2.营养水平均为实测值。1.2饲养管理每日颗粒料饲喂时间为8：30、14：30、20：30。依据3~6月龄马匹的采食量需求，对饲喂量进行合理调整，每周1次，维持每种处理中马匹的干物质采食量相同。在试验期，两种处理方式的马匹分栏饲养，保证马匹自由饮水，确保每日户外活动时间为6~7 h，每日清晨在饲喂马匹后打扫圈舍，定期消毒马舍，每周2~4次。试验结束后，宰前12 h停止饲喂马匹；将马匹腹腔切开，对肠道进行分离，采集各个肠段样本，取少量灭菌生理盐水进行预冷处理，冲洗，控制温度为4 ℃，并将其分转入离心管（1.5 mL）中，液氮速冻，保存于-80 ℃冷冻环境下。1.3试验方法1.3.1马匹各肠段的RNA检测使用高通量组织研磨仪（Grinder公司）制备组织匀浆；采用RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取RNA；采用One Drop测定总RNA纯度、浓度等，并对其纯度进行评估，使用1%的甲醛变性琼脂糖凝胶进行电泳，评价RNA，确定其是否存在降解。1.3.2cDNA合成此项试验在冰上进行，采用反转录试剂盒（TAKaRa）处理，取2 μL的PrimeSeript RT Master Mix、ddH2O和RNA组成10 μL体系。采用PCR仪进行反转录，反应条件为85 ℃变性5 s，37 ℃扩增15 min，4 ℃保存，长期保存温度为-20 ℃。1.3.3引物设计与实时荧光定量PCR条件采用Primer软件设计PCR引物并合成，引物序列及参数见表2。稀释引物，以GAPDH为内标，对其mRNA进行定量分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.013.T002表2引物序列及参数目的基因GenBank登录号引物序列（5'→3'）产物大小/bpPepT1NM_001099378.1F：TGTTCTGGGCCTTGTTTGAT163R：GGATATACCACGGCATCCACPHT1NM_001101927.2F：ATCCAGCAGAACGTGAGCTT202R：CTTCACCGCTAGGACTGTGCPepT2NM_001079582.1F：TTATGGCATGAAAGCTGTGC150R：TTTCCCAACCATGAGTCAGCPHT2XM_002699238.3F：CCACCTGCTTGACCCTTTAC158R：GGGACACAGTCTGGTTGTGA甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）NM_001034034.2F：GGGTCATCATCTCTGCACCT176R：GGTCATAAGTCCCTCCACGA以马回肠、十二指肠、盲肠和空肠组织中cDNA为模板，观测PCR仪器上的反映情况，检测结束后评估PCR的反应特异性。1.4数据统计与分析由扩增曲线得出PCR扩增的Ct，依据公式2-△Ct推导出目的基因量，并依据公式△Ct=Ct目的基因-Ct管家基因，计算PepT1、PHT1、PepT2、PHT2基因的GAPDH表达丰度。2结果与分析2.1总RNA质量及反转录效果（见图1）总RNA的OD260 nm/OD280 nm介于1.8~2.0，使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，在此基础上进行检测。未降解的RNA样品可完整显示28 S、18 S带，且其亮度比为2∶1，表明提取的RNA纯度较高、质量可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.013.F001图1总RNA凝胶电泳检测结果2.2GAPDH、PepT1、PHT1、PepT2和PHT2的实时荧光定量PCR（见图2）GAPDH、PepT1、PHT1、PepT2和PHT2基因的PCR扩增产物的退火温度（Tm）分别为87.16、86.42、88.90、84.67、86.42 ℃。由图2可知，依据表2所给产物大小对相应条带进行判定，为目的基因扩增产物。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.013.F002图2实时荧光定量PCR电泳检测结果注：M为分子质量标准；1为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）；2为PepT1；3为PepT2；4为PHT1；5为PHT2。2.3马肠道各段组织中PepT1和PepT2 mRNA的表达（见图3）由图3可知，马十二指肠和空肠的PepT1 mRNA表达丰度极显著高于回肠、结肠和盲肠（P0.01）；与盲肠相比，结肠PepT1 mRNA表达丰度更高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.013.F003图3马肠道中PepT1和PepT2 mRNA的表达注：大写字母不同表示差异极显著（P0.01），小写字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.4马肠道各段组织中PepT1、PHT1、PepT2和PHT2 mRNA的表达（见图4）图4马各肠段中的PepT1、PHT1、PepT2和PHT2 mRNA表达注：*表示差异显著（P0.05），**表示差异极显著（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.013.F4a1（a）PepT1基因表达10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.013.F4a2（b）PepT2基因表达10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.013.F4a3（c）PHT1基因表达10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.013.F4a4（d）PHT2基因表达由图4（a）可知，处理Ⅰ的马十二指肠和空肠PepT1 mRNA表达极显著高于处理Ⅱ（P0.01），结肠PepT1 mRNA表达显著高于处理Ⅱ（P0.05）。由图4（b）可知，与处理Ⅱ相比，处理Ⅰ的马的十二指肠、结肠PepT2 mRNA表达丰度极显著升高（P0.01）。由图4（c）可知，与处理Ⅱ相比，处理Ⅰ的马盲肠PHT1 mRNA表达丰度及显著降低（P0.01），回肠和结肠PHT1 mRNA表达丰度显著升高（P0.05）；由图4（d）可知，处理Ⅰ的马十二指肠、结肠PHT2 mRNA表达丰度极显著升高（P0.01），盲肠PHT2 mRNA表达丰度极显著降低（P0.01）。3讨论3.1马肠道中PepT1、PepT2 mRNA的表达对单胃动物的研究表明，PepT1 mRNA在小肠中表达明显。泌乳奶牛和绵羊的PepT1 mRNA主要在空肠和回肠中表达，而在十二指肠中表达较少，在结肠和盲肠中不表达[3-4]。有研究发现，马各个肠段的PepT1 mRNA表达丰度不同，在回肠中的表达最高，其次是空肠和十二指肠，在结肠中的表达最低[5]。也有研究表明，PepT1 mRNA表达肠段最高的是空肠，其次是回肠、盲肠、十二指肠，表达最低的是结肠[6-8]。本研究结果显示，在马肠道中，PepT1 mRNA主要在空肠和十二指肠表达，与以往研究结果存在一定差异，可能与动物品种、日龄等因素有关，还可能与日粮组成密切相关。具体因素、影响程度等有待进一步研究[9]。有报道显示，在马匹肠道中，小肽吸收的主要部位是十二指肠，与本研究结果一致。此外，本研究发现，与精粗比为65∶35的日粮相比，饲喂精粗比为75∶25的日粮能够促进马肠道中PepT1 mRNA的表达，原因可能与日粮中蛋白质来源不同有关[10]。PepT2是肽转运蛋白之一，在牛、大鼠等动物的大脑、乳腺、肾脏和胰腺等组织细胞中均可以表达[11]。有研究对猴子肠道的PepT2 mRNA表达情况进行分析，发现猴子肠道并不表达PepT2 mRNA，而人体肠道中少量表达PepT2 mRNA。3.2马肠道中PHT1和PHT2 mRNA的表达PHT1是1种转运蛋白，对肌肽和组氨酸等均有较高的亲和力。有研究应用免疫组织化学分析法对PHT1的表达进行研究，发现在小肠绒毛上皮中PHT1广泛表达[12-13]。本研究结果显示，在肠道中，PHT1 mRNA表达广泛，且表达丰度最高的位置为盲肠，表达最低的为结肠；饲喂精粗比为75∶25的日粮时，马回肠和结肠PHT1 mRNA的表达丰度均高于饲喂精粗比为65∶35的日粮，且盲肠中表达丰度更低。原因可能与反刍动物盲肠的消化率有关，反刍动物盲肠在消化粗纤维时具有更高消化率。PHT2可以介导组氨酸转运，但并不会甘氨酸吸收产生介导[14]。本研究结果显示，PHT2 mRNA在马肠道中广泛表达，盲肠表达丰度最高；与精粗比为65∶35的日粮相比，饲喂精粗比为75∶25的日粮时，马十二指肠和结肠的PHT2 mRNA表达丰度更高，盲肠表达丰度更低。原因可能是反刍动物盲肠对于粗纤维的消化率更高[15]。4结论与精粗比为65∶35的日粮相比，精粗比为75∶25的日粮促进马肠道中小肽转运蛋白mRNA表达的作用更显著。