使用抗生素会增强致病菌的耐药性，加大疾病防控难度。中药作为天然植物，在微生物发酵后，具有提高药效、降低毒性、产生新成分等优势，可以作为绿色饲料添加剂替代抗生素[1]。中药含有众多对动物的生产和免疫力广泛影响的活性成分[2]。益生菌含有丰富的营养物质，在肠道内通过和致病菌互作来抵御致病菌对肠道黏膜的黏附，调节菌群平衡，影响黏膜免疫[3]。而且益生菌的代谢产物可以增加肠道的屏障功能、抑制炎症反应及调节免疫反应，实现维持和改善健康以及降低某些疾病的风险。微生物发酵中药饲料添加剂将两者有机结合，通过益生菌的代谢产物和酶解作用使中药活性成分增加[4]。中药复方因绿色天然、不良反应小，深受国内外学者的关注[5-6]。Zhao[7]、Englezos等[8]研究表明，发酵过程中，单一菌株很难完成众多生化反应过程，因此混菌发酵逐渐发展起来，针对中药复方的研究增多。中药发酵后可以作为饲料添加剂来改变饲料底物的理化特性，在改善动物生长性能、肉质水平、增强免疫力等方面均具有良好的效果。本试验选用植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌对黄芪、绞股蓝、马齿苋构成的中药组方进行混菌发酵，为新型天然植物饲料添加剂的研制与应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料植物乳杆菌（编号1.191）由广东省微生物菌种保藏中心保藏；枯草芽孢杆菌（FSCC 115036）购自广东环凯微生物科技有限公司；中药黄芪、绞股蓝、马齿苋购自河北安国药材市场。MRS培养基、LB培养基（北京索莱宝科技有限公司）用于植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的活化和培养。1.2试验菌种的活化与扩培将植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌分别于相应的固体培养基上划线接种，在37 ℃恒温培养箱中过夜培养，分别挑取单菌落于相应液体培养基中，植物乳杆菌静态培养[9]，枯草芽孢杆菌于150 r/min摇床上进行培养。分别吸取2%培养菌液接入相应的液体培养基，培养24 h，获得发酵用种子液，放入冰箱中冷藏，备用。1.3发酵中药培养基的制备分别取黄芪、绞股蓝、马齿苋3种中药，超微粉碎，过300目筛，制备发酵中药培养基。制备方法如下：复方中药粉（3种中药粉按1∶1∶1比例混合）10 g、黑豆粉（提供氮源）3 g（过60目筛）、葡萄糖（提供碳源）2 g、100 mL蒸馏水，灭菌，备用。1.4单因素多水平试验确定中药发酵条件分别取20 mL发酵中药培养基置于锥形瓶中，放入恒温振荡培养箱根据设计的参数进行发酵，以发酵后中药液的粗多糖得率为指标，对两种菌液接种比例、发酵时间、菌液接种量、发酵温度4个单因素进行探索，对各因素进行优化。1.4.1菌液接种比例的优化设定初始接种剂量4%、发酵温度37 ℃、发酵时间48 h，分别以植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌混菌比例为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3以及单菌4%植物乳杆菌（植4%）和4%单菌枯草芽孢杆菌（枯4%）的7个因素水平，筛选最佳的混菌比例。每组设3个平行，下同。1.4.2发酵时间的优化设定初始混菌接种比例2∶1、接种剂量4%、发酵温度37 ℃，发酵时间分别为12、24、36、48、60、72 h共6个因素水平，筛选最佳的发酵时间。1.4.3接种剂量的优化设定初始混菌接种比例2∶1、发酵时间48 h、发酵温度37 ℃，接种剂量分别为2%、3%、4%、5%、6%、7%共6个因素水平，筛选最佳的接种剂量。1.4.4发酵温度的优化设定初始混菌接种比例2∶1、接种剂量4%、发酵时间48 h，发酵温度分别为31、33、35、37、39、41 ℃共6个因素水平，筛选最佳的发酵温度。1.5正交试验优化发酵工艺条件根据单因素条件筛选的试验结果，选取影响发酵液中粗多糖含量各因素中最适参数作正交试验，对结果进行极差分析，以确定最佳的发酵条件。主要因素为发酵温度（A）、发酵时间（B）、混菌比例（C）、接种剂量（D），进行正交优化试验，每个因素设3个水平，每组设2个平行试验。正交试验设计见表1。优化益生菌发酵中药液的工艺参数，评估各因素对发酵效果影响的主次作用，最后在最佳工艺条件下验证结果是否合理。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.014.T001表1L9（34）正交试验设计水平A发酵温度/℃B发酵时间/hC混菌比例D接种量/%133363∶13235482∶14337601∶251.6测定指标及方法发酵液中粗多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[10]。1.6.1对照品葡萄糖标准溶液的制备精密称取葡萄糖标准品10 mg，加蒸馏水溶解定容至100 mL，即得0.1 g/L葡萄糖标准溶液。1.6.2供试品溶液的制备采用水提醇沉法将发酵液3 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液于10 mL离心管，加入3~4倍无水乙醇充分混合，静置过夜，4 000 r/min离心10 min，弃去上清液，利用少量80%乙醇溶液重新洗涤沉淀，离心去上清液，使用热水将沉淀转移至200 mL容量瓶中，定容摇匀，即得供试品溶液。1.6.3最大吸收波长的选择精密吸取0.5 mL标准溶液于10 mL具塞比色管中，加入蒸馏水补至1.0 mL，另取1.0 mL蒸馏水作空白对照。分别加入1.0 mL 5%苯酚水溶液，加入5.0 mL浓硫酸，静置10 min，漩涡振荡器上充分混匀，80 ℃水浴加热20 min，取出，在冰水浴中迅速冷却，在200~600 nm的波长范围进行检测，结果在490 nm附近有特征吸收峰。因此，选择此标准为测定波长。1.6.4标准曲线的绘制精密吸取0.1 g/L葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于具塞比色管中，用蒸馏水补至1.0 mL，按1.6.3进行操作，使用紫外可见分光光度计在490 nm处测定吸光值。葡萄糖标准曲线见图1。计算回归方程为y=10.374x+0.028 4，R2=0.997 8。由图1可知，葡萄糖的质量浓度在0.01~0.10 g/L内与吸光度呈良好的线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.014.F001图1葡萄糖标准曲线1.6.5样品含量的测定精密吸取1 mL供试品溶液于10 mL具塞比色管中，按1.6.3进行操作，在490 nm处测定吸光度值后带入回归方程计算粗多糖含量。1.7数据统计与分析试验所得数据采用SPSS 21.0处理、分析。单因素筛选试验数据进行单因素方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较，正交试验数据进行极差分析及方差分析。2结果与分析2.1中药发酵单因素优化结果2.1.1菌液接种比例对粗多糖含量的影响（见图2）由图2可知，当植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌的混菌比例为2∶1时，发酵液中粗多糖的含量最高。因此，设定最佳菌液接种比例为2∶1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.014.F002图2接菌比例对粗多糖含量的影响2.1.2发酵时间对粗多糖含量的影响（见图3）由图3可知，随着发酵时间的增加，发酵液中粗多糖的含量随之增加，当发酵时间到48 h，发酵液中粗多糖的含量达到最高。因此，为了缩短周期，降低成本，设定发酵最佳时间为48 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.014.F003图3发酵时间对粗多糖含量的影响2.1.3接种量对粗多糖含量的影响（见图4）由图4可知，随着菌液接种剂量加大，发酵液中粗多糖的含量增加，当菌液接种剂量为4%时，发酵液中粗多糖的含量最高。因此，设定发酵的最佳接种剂量为4%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.014.F004图4接种量对粗多糖含量的影响2.1.4发酵温度对粗多糖含量的影响（见图5）由图5可知，随着发酵温度的升高，发酵液中粗多糖的含量随之增加，当发酵温度为35 ℃时，发酵液中粗多糖的含量最高。因此，确定最佳的发酵温度为35 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.014.F005图5发酵温度对粗多糖含量的影响2.2中药发酵工艺正交试验结果（见表2、表3）由表2、表3可知，4个因素对粗多糖含量的影响大小依次为温度时间混菌比例接种量，其中温度差异性影响极显著，可能因为培养温度影响乳酸菌菌体的生长代谢，也影响其相应的生物代谢酶系活性。根据k值大小可知，最佳组合为A2B2C2D1，即发酵温度35 ℃，发酵时间48 h，混菌比例2∶1，接种剂量3%。在该发酵条件下进行验证试验，发酵液中粗多糖含量为12.116 g/L，高于正交表中任一组合。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.014.T002表2正交试验结果项目ABCD粗多糖/(g/L)1111110.5662122211.1743133310.3844212311.2705223111.5986231211.020731329.6518321310.4999332110.316k110.70810.53110.73010.878k211.29611.04610.87610.611k310.15610.58310.55410.672R1.1400.5150.3220.26710.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.014.T003表3方差分析结果项目Ⅲ型平方和自由度均方F值P值A3.90221.95135.005P0.01B0.87720.4397.868P0.05C0.28220.1412.534P0.05D0.19520.0981.753P0.05误差0.50290.056校正的总计6.28217注：P0.05表示影响不显著，P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。3讨论黄芪、绞股蓝、马齿苋3味中药均属于可饲用天然植物，主要用于增强机体免疫力、抗病毒等。黄芪是常用中药材，性味甘、补肺健脾，具有补气消肿之功效[11]。绞股蓝具有补益元气、生津健脾、平喘等功效，多用其消炎解毒、止咳祛痰[12]。马齿苋味酸、性寒，主治热痢脓血，具有解毒消炎的功效[13]。3种中药所含成分主要为多糖、皂苷、黄酮等。发酵前期枯草芽孢杆菌快速生长繁殖，消耗氧气。随着氧气的减少，植物乳杆菌开始生长繁殖，产生乳酸使pH值逐渐降低，且有效地控制其他杂菌的感染[14]。发酵效果受温度、时间、菌液接种量等因素的影响[15]。在微生物发酵过程中，温度的升高会使酶反应速率加快，进而提高某些代谢产物的含量。但是，超过最适温度时，催化活性反而下降，导致发酵的效果受到影响[16-17]。当微生物处于最适生长温度时，新陈代谢增强[18]。王增元等[19]研究表明，温度对于发酵花生粕中多肽和总酸的影响显著，且发酵效果在一定范围内会随温度的升高而降低。发酵温度要根据菌种、培养条件等因素综合选择。发酵时间对于发酵产物质量具有很大影响。合理控制发酵时间、及时终止发酵可以很好地保障产品质量[20-21]。在发酵过程中，细菌的快速生长使营养物质大量消耗，随着发酵时间的延长，会导致菌体老化。吴正可等[22]研究发现，菜籽粕的发酵效果随着时间的增加，呈现先增高后降低的趋势，说明菜籽粕在发酵过程中并非时间越久越好。在混菌发酵过程中，菌体之间存在相辅相成和相互制约的关系。吴宝昌等[23]研究表明，当黑曲霉菌与枯草芽孢杆菌的菌种比例为2∶1时，此时大豆肽转化率达到最高。接种量决定起始菌数量，接种量少会使起始菌浓度低，菌群繁殖较慢，产物积累较少；而接种量过多，加快细菌的繁殖和代谢，营养物质会加快消耗，不利于发酵产物的积累[24-25]。韩愈杰等[26]研究发现，在发酵双黄连药渣过程中，接种量对其检测物质的含量有显著影响。因此，合适的接种剂量能够缩短益生菌的生长繁殖期，快速进入发酵阶段[27]。4结论植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌混合菌种发酵由黄芪、绞股蓝、马齿苋组成的复方中药的最优发酵条件为：植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌接菌比例2∶1、发酵时间48 h、发酵温度35 ℃、接菌量3%，粗多糖含量为12.116 g/L。