黑龙江省是重要的粮食基地,也是玉米的主产区,玉米秸秆产量非常可观[1-2]。因此,可以将玉米秸秆进行青贮并作为优质饲料饲喂反刍动物[3]。农药在农作物种植阶段不可或缺[4],但是容易导致玉米植株中药物残留。近年来,氨基甲酸酯类农药残留问题逐渐得到关注[5-6]。禾草丹[thiobencarb, S-(4-chlorobenzyl) N, N-diethylthiocarbamate]是1种硫代氨基甲酸酯类广谱除草剂,主要用于玉米地和水稻田等的杂草防治[7]。玉米地的杂草主要为稗草、狗尾草、牛筋草等,其中禾草丹对稗草的防治效果较好。但是,禾草丹的毒性较高,在厌氧条件下难以降解,对哺乳动物神经系统损害明显,且易在肝肾部位蓄积[8-10]。禾草丹作为常用除草剂,会在寒地黑土中不断累积,导致土壤中氨基甲酸酯农药富集并迁移至玉米和秸秆[11-15]。反刍动物主要以玉米秸秆作为饲料,饲料中残留的农药危害动物健康的同时,会将残留农药带入食物链,危害人类健康[16]。我国饲料中氨基甲酸酯类农药残留量的最小检测浓度为0.02 mg/kg(GB/T 19373—2003),在食品中规定禾草丹的最大残留量为0.2 mg/kg(GB 2763—2021)[17];日本规定其在水产品中的残留量为10 μg/kg[18]。禾草丹的降解包括化学降解、动植物体内代谢和微生物降解[19]。其中,微生物降解禾草丹最终可被降解为丙酮酸和草酰乙酸,进入三羧酸循环[20]。Torra-Reventós等[21]从土壤中分离出1株黑曲霉可降解禾草丹,在最适条件下可以在2 d内降解约20 mg/L的禾草丹。褚翠伟[22]从农药厂家的土壤中分离出1株食酸菌属,食酸菌属36 h内对0.4 mmol/L禾草丹的降解率达95.4%。本研究从长期使用禾草丹的寒地黑土玉米种植地,分离筛选出2株高效降解禾草丹菌株,为保证秸秆饲料的安全提供有效方法,也为微生物法降解禾草丹提供优良降解菌株。1材料与方法1.1试验材料选择黑龙江省宾县(127.49°E、45.76°N)、鸡西(130.98°E、45.30°N)、牡丹江(129.58°E、44.60°N)、黑河(127.53°E、50.22°N)的玉米地地表15~20 cm处分别采集土壤样品,并使用无菌袋分装。1.2试验试剂与设备90%禾草丹乳油购自辽宁省沈阳市和田化工有限公司;重铬酸钾购自天津市申泰化学试剂有限公司;孟加拉红、去氧胆酸钠、链霉素,均购自北京博奥拓达科技有限公司;二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)、硫代乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶,均购自上海易恩化学技术有限公司;DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒 GK2043,均购自上海捷瑞生物工程有限公司。SoftMax®Pro6 Software SMP6酶标仪购自Molecular Devices(美国分子仪器公司);HNY-100B恒温振荡器购自天津市欧诺仪器仪表有限公司;LRH-70F恒温培养箱购自上海一恒科技有限公司。1.3试验方法1.3.1禾草丹降解菌培养基的配制细菌培养基:蛋白胨3 g、NaCl 1.5 g、水300 mL、琼脂6 g,调节pH值至7.2~7.4。放线菌培养基:KNO3 3 g、KH2PO4 0.15 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、水300 mL、琼脂5.4 g,灭菌后加入0.99 mL 3%重铬酸钾溶液,调节pH值至7.2~7.4。真菌培养基:蛋白胨1.5 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、0.99 mL 1%孟加拉红溶液、蒸馏水300 mL、琼脂6 g,灭菌后加入6 mL 2%去氧胆酸钠溶液、0.99 mL的1 000 U/mL链霉素溶液。在上述培养基中分别加入0.9 mL的0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L的禾草丹。1.3.2降解菌的分离筛选取不同地区5 g样品,分别溶于45 mL无菌水,摇床180 r/min振荡20 min,取出,静置,吸取1 mL上清液,按倍比稀释法制得10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 mL土壤稀释液。涂布平板的稀释梯度经过活菌数培养的预试验,细菌、放线菌、真菌分别选取10-6~10-4、10-5~10-3、10-3~10-1范围。分别吸取各土壤稀释液100 μL,将稀释液在平板中涂布均匀,将细菌平板置于37 ℃恒温培养箱培养24 h,真菌、放线菌平板置于28 ℃恒温培养箱分别培养5 d和3 d,观察菌株生长情况并对其进行编号,每组3个重复。观察细菌、放线菌、真菌在平板上的菌落生长情况,选取生长旺盛的菌落,采用96孔板法进行对禾草丹的降解。每孔内注入0.2 mL 0.1 mg/L的禾草丹,利用接种针轻挑一针菌落,挑取形态各异的菌落于96孔板内,37 ℃恒温培养,在340 nm下分别测各株菌48 h的吸光值并记录,吸光值显著增加的即为降解菌。1.3.3菌株的鉴定1.3.3.1菌株的形态特征将孔板中吸光度值高的菌落挑取进行平板划线、纯化,观察菌落形态。挑取单菌落进行革兰氏染色,利用光学显微镜观察经染色后菌体的形态。1.3.3.2DNA提取及16S rDNA基因的PCR扩增采用DNA试剂盒提取菌株基因组;PCR扩增体系:采用30 µL体系,即3 µL 10×Taq Buffer、1 µL dNTP、21 µL H2O、1 µL上游引物(10 µmol/L)、1 µL下游引物(10 µmol/L)、2 µL模板。前后引物为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR扩增条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s(35个循环);72 ℃末端延伸5 min;进行PCR产物胶回收。1.3.3.3C6和F6菌株系统发育的构建交由上海捷瑞生物有限公司进行测序,得到降解菌株C6和F6的基因序列。降解菌16S rDNA基因序列通过BLAST程序与GenBank中核酸数据进行比对分析。利用MEGA-X软件构建系统发育树,采用Neighbor-joining法进行系统发育分析。1.3.4玉米秸秆样品预处理取秸秆样品,冲洗掉表面泥土,剪成约1 cm见方的碎片,称取5 g放入烧杯,加入50 mL pH值为8.0的无水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲溶液,振荡1~2 min,倒出提取液,静置5 min,检测提取液中禾草丹农药的浓度。以禾草丹为唯一碳源的培养基:秸秆禾草丹洗脱液0.9 mL、蛋白胨3 g、NaCl 1.5 g、水300 mL,调节pH值至7.2~7.4。1.3.5单因素试验对秸秆中禾草丹的降解率的影响将菌株C6接种到以禾草丹为唯一碳源的液体培养基中,30 ℃、摇床140 r/min培养48 h,分别选取培养基pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,确定最适pH值。分别选取接种量为1%、2%、3%、4%、5%的培养基,确定最佳接种量。使用250 mL的锥形瓶,装液量分别为30、50、70、90、110 mL,确定最适装液量。600 nm下测定C6菌株生长量的吸光值,412 nm下测定其酶抑制率。1.3.6正交试验优化以pH值、接种量、装液量为因素、选取3种水平,以降解率为指标,进行L9(34)正交试验,确定最佳降解条件。L9(34)正交试验因素水平设计。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.T001表1L9(34)正交试验因素水平设计水平A pH值B接种量/%C装液量/mL16.537027.049037.551101.3.7禾草丹的检测方法采用GB/T 5009.199—2003测定秸秆中禾草丹的含量。1.3.8禾草丹降解率的计算方法I=(ΔA0-ΔA)/ΔA0 (1)式中:I为抑制率(%);ΔA0为对照样本反应3 min后吸光度变化值;ΔA为待测样本反应3 min后吸光度变化值。Y=A2+(A1-A2)/[1+(X/X0)P](2)该式为禾草丹的标准抑制曲线回归方程,式中:Y为抑制率(%);X为农药浓度(μg/L);A1为检测范围内最低检测浓度禾草丹农药的抑制率(%);A2为检测范围内最高检测浓度禾草丹的抑制率(%);P为曲线拐点的斜率;X0为IC50(μg/L)。D=(C1-C2)/C1×100%(3)式中:D为降解率(%);C1为秸秆中农药残留的初始浓度(mg/L);C2为菌株降解后秸秆中农药残留的浓度(mg/L)。1.4数据统计与方法试验中所有数据均进行3次平行试验,利用Origin 2019和SPSS对单因素试验、正交试验进行数据处理,数据结果以“平均值±标准差”表示,P0.05表示差异显著。2结果与讨论2.1禾草丹浓度对微生物生长的影响(见表2)由表2可知,禾草丹对细菌、真菌、放线菌均有抑制作用,随着禾草丹浓度增加,3种菌落总数均明显减少。当培养基中禾草丹浓度为0.05 mg/L时,黑河土壤样品中的细菌、放线菌、真菌的数量分别为7.21×106、3.08×106、2.71×106 CFU/g;当禾草丹浓度为0.2 mg/L时,样品中的细菌、放线菌、真菌的数量分别为9.0×105、4.2×105、2.2×105 CFU/g,说明禾草丹浓度的增加抑制了土壤中微生物的生长。在禾草丹浓度相同时,4个地区土壤中宾县样品的细菌、放线菌、真菌3类微生物数量均最多,当禾草丹浓度为0.05 mg/L时,细菌、放线菌、真菌的含量分别为1.064×107、3.87×106、3.21×106 CFU/g,所以宾县土壤有利用禾草丹能力较好的微生物,且3类微生物中细菌菌落数最多。因此,将细菌平板上的菌落进行编号,进一步筛选降解菌株。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.T002表2禾草丹浓度对微生物生长的影响项目禾草丹浓度/(mg/L)土壤样品来源黑河鸡西牡丹江宾县细菌的数量0.0572.1±11.474.3±12.678.1±13.0106.4±10.10.1049.3±7.853.9±4.756.8±6.378.6±12.00.1527.6±4.231.4±2.533.3±1.654.2±6.20.209.0±1.211.2±3.110.8±2.621.5±2.7放线菌的数量0.0530.8±2.334.5±3.135.1±2.638.7±1.80.1016.4±1.717.4±2.518.1±4.420.0±2.40.158.3±3.38.6±3.69.0±2.29.9±1.50.204.2±2.74.4±1.94.5±3.44.7±1.3真菌的数量0.0527.1±1.629.3±2.430.4±3.232.1±1.50.1010.4±2.111.2±1.512.3±2.213.5±3.10.155.4±3.15.6±1.66.0±1.16.3±3.10.202.2±1.42.4±2.12.7±3.23.2±1.6×105 CFU/g2.2培养48 h后各菌株的吸光值(见表3)孔板中农药基本呈透明色,每个菌落用接种针点取时保持菌体量一致。留一排未接种菌落的为对照组(H4~H12为空白组)。由表3可知,孔板中可见C6、D5、D8、E7、F6浑浊度较高,同时吸光值明显升高,吸光值分别为1.152、0.962、0.882、0.936、1.026,与空白组(0.381~0.445)相比有明显的升高。表明该5株菌可以使0.1 mg/L的禾草丹为唯一碳源能生长,具有降解禾草丹的能力。将5株菌挑取到牛肉膏蛋白胨斜面培养,C6、F6生长较快,说明2株菌利用禾草丹的能力较强,所以将C6、F6进行进一步鉴定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.T003表3培养48 h后各菌株的吸光值组别123456789101112A0.4110.4210.4820.4600.4370.3950.4390.7300.4860.4390.5130.463B0.4430.4480.4750.4830.4800.5170.5100.5440.4930.4910.4870.529C0.5120.4930.4440.4280.7351.1520.7400.4290.4730.4470.4950.462D0.5740.7210.5160.5710.9620.6320.8060.8820.5720.4820.5100.455E0.5080.7600.5520.6760.5720.7290.9360.7900.4900.5630.4110.445F0.5060.4900.5150.5100.8031.0260.7880.6210.4760.4800.5830.481G0.5270.6700.4830.5910.4500.4640.4570.5080.5160.4680.5260.504H0.5380.5930.4310.4000.3870.4560.4380.4090.4450.3810.4280.3962.3降解禾草丹菌株C6和F6的鉴定(见图1)挑取单菌落进行革兰氏染色,在10×100倍的光学显微镜下对2株降解菌进行观察。由图1可知,2株菌均为革兰阳性菌,菌株C6的菌落为圆形、呈乳白色、表面轻微凹陷、菌落直径为5 mm,显微镜观察菌体长度为2 μm;菌株F6菌落也为圆形、呈乳白色、表面平坦湿润、菌落直径为2 mm,显微镜观察菌体的长×宽为3 μm×1.3 μm。根据2株菌的大小及形态,可判定菌株C6和F6均为杆菌属(Bacillus)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F001图1菌株C6和F6的菌落特征及革兰氏染色2.4菌株C6和F6的系统进化分析2.4.1菌株PCR扩增产物分析(见图2)进一步对菌株C6与F6进行分子鉴定得到PCR扩增产物,其中M为marker的电泳条带(100~2 000 bp),1和2分别为菌株C6和F6电泳条带。由图2可知,PCR扩增产物约在1 000 bp处有清晰明亮条带且无弥散现象。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F002图2菌株C6和F6的PCR扩增电泳图2.4.2菌株C6和F6的16S rDNA序列分析及系统发育构建(见图3)根据16S rDNA测序结果,菌株C6和F6经过拼接后的序列全长分别为1 091 bp和1 070 bp。将全长序列在NCBI进行Blast比对,菌株C6与阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)、菌株F6与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的同源性分别高达99.35%和98.96%。利用MEGA-X构建系统发育树。由图3可知,菌株C6与模式株Bacillus aryabhattai MT184818.1、Bacillus aryabhattai KU877640.1、Bacillus aryabhattai KU161298.1在同一分支聚为一类且置信度为85%,菌株F6与模式株Bacillus thuringiensis MN84518.1、Bacillus thuringiensis KF836519.1、Bacillus thuringiensis MT706014.1在同一分支聚为一类且置信度为100%。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对细菌形态的描述,结合16S rDNA分子测序结果,鉴定为菌株C6为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai),菌株F6为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F003图3菌株C6和F6系统发育树冯玮等[23]从西藏土壤中分离出1株耐辐射的阿氏芽孢杆菌T61,表明其对抗UV辐射能力较强。俞英昉等[24]研究表明,苏云金芽孢杆菌GIM1.150和FJAJ—12均具有杀虫效果,说明2株菌具有良好的抗逆性。陈波[25]研究表明,高剂量苏云金芽孢杆菌对小鼠肾脏有危害;而阿氏芽孢杆菌被列入益生菌行列[26],为保证菌株在饲料中的使用安全性,进一步选择阿氏芽孢杆菌C6进行对禾草丹降解效率试验。2.5禾草丹的标准抑制曲线(见图4)经计算,曲线方程为y=92-72/(1+x/0.11)0.23,R2=0.957 53。秸秆洗脱液中禾草丹含量为0.12 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F004图4禾草丹农药的标准抑制曲线2.6菌株C6生长条件及禾草丹农药的降解特性2.6.1pH值对菌株C6生长及禾草丹降解效率的影响(见图5)由图5可知,pH值为6.5时,菌株C6生长量的OD600 nm值为1.32;pH值为7.0时,菌株C6对禾草丹的降解率为95.7%,菌株生长的最佳pH值低于农药降解最适pH值,可能因为菌株内降解禾草丹的单加氧酶最适pH值为7.0。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F005图5pH值对菌株C6生长和禾草丹降解效率的影响2.6.2接种量对菌株C6生长及禾草丹降解效率的影响(见图6)由图6可知,随着接种量的增加,菌株生长量和降解效率均呈先上升后下降趋势,当菌株生长的接种量为3%时,OD600 nm值达1.15;当接种量大于3%时,菌株生长量受到抑制,可能因为过多的接种量抑制了菌体的生长繁殖。当接种量为4%时,降解效率为95.8%,接种量大于4%时降解效率降低,可能因为过多的接种量降低了菌株内降解酶活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F006图6接种量对菌株C6生长和禾草丹降解效率的影响2.6.3装液量对菌株C6生长及禾草丹降解效率的影响(见图7)由图7可知,随着装液量的增加,菌株的生长量和降解效率均先上升后下降。当装液量为90 mL时,菌株的生长量OD600 nm值为1.29,降解率为93.2%,证明90 mL装液量时的传氧系数最适宜菌株的生长及降解。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F007图7装液量对菌株C6生长和禾草丹降解效率的影响2.7菌株C6最佳降解条件正交试验结果与方差分析(见表4、表5)由表4可知,各因素对菌株C6降解率影响的大小依次为C>B>A,即装液量>接种量>pH值。根据k值可知,优组合为A2B2C2,而从结果可以得出最优组合为A1B2C2,对两组合进行验证试验,A2B2C2组合的降解率为96.1%,最终得出A1B2C2组合最优。从而确定菌株C6的最佳降解条件为:pH值6.5、接种量4%、装液量90 mL,降解率为96.5%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.T004表4菌株C6最佳降解条件正交试验结果试验号ABC空列降解率/%11(6.5)1(3)1(70)166.5212(4)2(90)296.5313(5)3(110)392.142(7.0)12396.35223193.16231266.773(7.5)13292.58321367.29332195.9k185.085.166.885.2k285.485.696.285.2k385.284.992.685.2R0.40.729.4由表5可知,接种量和装液量极显著影响禾草丹的降解率,pH值显著影响禾草丹的降解率,与极差分析结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.T005表5方差分析结果方差来源平方和自由度均方F值P值显著性校正模型1 544.633a6257.43977 231.6670.000截距65 331.360165 331.3601.960×1070.000A0.16720.08325.0000.038*B0.78020.390117.0000.008**C1 543.6872771.843231 553.0000.000**误差0.00720.003总计66 876.0009校正的总计1 544.6408注:1.F0.05(2,2)=19,F0.01(2,2)=99。2.*表示差异显著,**表示差异极显著。3结论试验筛选的2株菌分别为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),对菌株C6对秸秆样品的降解率进行研究,确定菌株C6的最佳降解条件为pH值6.5、接种量4%、装液量90 mL,降解率为96.5%。本研究为降解秸秆中禾草丹农药残留提供优良降解菌株,也为保证饲料安全提供有效方法。
使用Chrome浏览器效果最佳,继续浏览,你可能不会看到最佳的展示效果,
确定继续浏览么?
复制成功,请在其他浏览器进行阅读
复制地址链接在其他浏览器打开
继续浏览