黑龙江省是重要的粮食基地，也是玉米的主产区，玉米秸秆产量非常可观[1-2]。因此，可以将玉米秸秆进行青贮并作为优质饲料饲喂反刍动物[3]。农药在农作物种植阶段不可或缺[4]，但是容易导致玉米植株中药物残留。近年来，氨基甲酸酯类农药残留问题逐渐得到关注[5-6]。禾草丹[thiobencarb, S-(4-chlorobenzyl) N, N-diethylthiocarbamate]是1种硫代氨基甲酸酯类广谱除草剂，主要用于玉米地和水稻田等的杂草防治[7]。玉米地的杂草主要为稗草、狗尾草、牛筋草等，其中禾草丹对稗草的防治效果较好。但是，禾草丹的毒性较高，在厌氧条件下难以降解，对哺乳动物神经系统损害明显，且易在肝肾部位蓄积[8-10]。禾草丹作为常用除草剂，会在寒地黑土中不断累积，导致土壤中氨基甲酸酯农药富集并迁移至玉米和秸秆[11-15]。反刍动物主要以玉米秸秆作为饲料，饲料中残留的农药危害动物健康的同时，会将残留农药带入食物链，危害人类健康[16]。我国饲料中氨基甲酸酯类农药残留量的最小检测浓度为0.02 mg/kg（GB/T 19373—2003），在食品中规定禾草丹的最大残留量为0.2 mg/kg（GB 2763—2021）[17]；日本规定其在水产品中的残留量为10 μg/kg[18]。禾草丹的降解包括化学降解、动植物体内代谢和微生物降解[19]。其中，微生物降解禾草丹最终可被降解为丙酮酸和草酰乙酸，进入三羧酸循环[20]。Torra-Reventós等[21]从土壤中分离出1株黑曲霉可降解禾草丹，在最适条件下可以在2 d内降解约20 mg/L的禾草丹。褚翠伟[22]从农药厂家的土壤中分离出1株食酸菌属，食酸菌属36 h内对0.4 mmol/L禾草丹的降解率达95.4%。本研究从长期使用禾草丹的寒地黑土玉米种植地，分离筛选出2株高效降解禾草丹菌株，为保证秸秆饲料的安全提供有效方法，也为微生物法降解禾草丹提供优良降解菌株。1材料与方法1.1试验材料选择黑龙江省宾县（127.49°E、45.76°N）、鸡西（130.98°E、45.30°N）、牡丹江（129.58°E、44.60°N）、黑河（127.53°E、50.22°N）的玉米地地表15~20 cm处分别采集土壤样品，并使用无菌袋分装。1.2试验试剂与设备90%禾草丹乳油购自辽宁省沈阳市和田化工有限公司；重铬酸钾购自天津市申泰化学试剂有限公司；孟加拉红、去氧胆酸钠、链霉素，均购自北京博奥拓达科技有限公司；二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）、硫代乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶，均购自上海易恩化学技术有限公司；DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒 GK2043，均购自上海捷瑞生物工程有限公司。SoftMax®Pro6 Software SMP6酶标仪购自Molecular Devices（美国分子仪器公司）；HNY-100B恒温振荡器购自天津市欧诺仪器仪表有限公司；LRH-70F恒温培养箱购自上海一恒科技有限公司。1.3试验方法1.3.1禾草丹降解菌培养基的配制细菌培养基：蛋白胨3 g、NaCl 1.5 g、水300 mL、琼脂6 g，调节pH值至7.2~7.4。放线菌培养基：KNO3 3 g、KH2PO4 0.15 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、水300 mL、琼脂5.4 g，灭菌后加入0.99 mL 3%重铬酸钾溶液，调节pH值至7.2~7.4。真菌培养基：蛋白胨1.5 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、0.99 mL 1%孟加拉红溶液、蒸馏水300 mL、琼脂6 g，灭菌后加入6 mL 2%去氧胆酸钠溶液、0.99 mL的1 000 U/mL链霉素溶液。在上述培养基中分别加入0.9 mL的0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L的禾草丹。1.3.2降解菌的分离筛选取不同地区5 g样品，分别溶于45 mL无菌水，摇床180 r/min振荡20 min，取出，静置，吸取1 mL上清液，按倍比稀释法制得10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 mL土壤稀释液。涂布平板的稀释梯度经过活菌数培养的预试验，细菌、放线菌、真菌分别选取10-6~10-4、10-5~10-3、10-3~10-1范围。分别吸取各土壤稀释液100 μL，将稀释液在平板中涂布均匀，将细菌平板置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，真菌、放线菌平板置于28 ℃恒温培养箱分别培养5 d和3 d，观察菌株生长情况并对其进行编号，每组3个重复。观察细菌、放线菌、真菌在平板上的菌落生长情况，选取生长旺盛的菌落，采用96孔板法进行对禾草丹的降解。每孔内注入0.2 mL 0.1 mg/L的禾草丹，利用接种针轻挑一针菌落，挑取形态各异的菌落于96孔板内，37 ℃恒温培养，在340 nm下分别测各株菌48 h的吸光值并记录，吸光值显著增加的即为降解菌。1.3.3菌株的鉴定1.3.3.1菌株的形态特征将孔板中吸光度值高的菌落挑取进行平板划线、纯化，观察菌落形态。挑取单菌落进行革兰氏染色，利用光学显微镜观察经染色后菌体的形态。1.3.3.2DNA提取及16S rDNA基因的PCR扩增采用DNA试剂盒提取菌株基因组；PCR扩增体系：采用30 µL体系，即3 µL 10×Taq Buffer、1 µL dNTP、21 µL H2O、1 µL上游引物（10 µmol/L）、1 µL下游引物（10 µmol/L）、2 µL模板。前后引物为27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s（35个循环）；72 ℃末端延伸5 min；进行PCR产物胶回收。1.3.3.3C6和F6菌株系统发育的构建交由上海捷瑞生物有限公司进行测序，得到降解菌株C6和F6的基因序列。降解菌16S rDNA基因序列通过BLAST程序与GenBank中核酸数据进行比对分析。利用MEGA-X软件构建系统发育树，采用Neighbor-joining法进行系统发育分析。1.3.4玉米秸秆样品预处理取秸秆样品，冲洗掉表面泥土，剪成约1 cm见方的碎片，称取5 g放入烧杯，加入50 mL pH值为8.0的无水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲溶液，振荡1~2 min，倒出提取液，静置5 min，检测提取液中禾草丹农药的浓度。以禾草丹为唯一碳源的培养基：秸秆禾草丹洗脱液0.9 mL、蛋白胨3 g、NaCl 1.5 g、水300 mL，调节pH值至7.2~7.4。1.3.5单因素试验对秸秆中禾草丹的降解率的影响将菌株C6接种到以禾草丹为唯一碳源的液体培养基中，30 ℃、摇床140 r/min培养48 h，分别选取培养基pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，确定最适pH值。分别选取接种量为1%、2%、3%、4%、5%的培养基，确定最佳接种量。使用250 mL的锥形瓶，装液量分别为30、50、70、90、110 mL，确定最适装液量。600 nm下测定C6菌株生长量的吸光值，412 nm下测定其酶抑制率。1.3.6正交试验优化以pH值、接种量、装液量为因素、选取3种水平，以降解率为指标，进行L9（34）正交试验，确定最佳降解条件。L9（34）正交试验因素水平设计。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平A pH值B接种量/%C装液量/mL16.537027.049037.551101.3.7禾草丹的检测方法采用GB/T 5009.199—2003测定秸秆中禾草丹的含量。1.3.8禾草丹降解率的计算方法I=(ΔA0－ΔA)/ΔA0 (1)式中：I为抑制率（%）；ΔA0为对照样本反应3 min后吸光度变化值；ΔA为待测样本反应3 min后吸光度变化值。Y=A2+(A1-A2)/[1+(X/X0)P](2)该式为禾草丹的标准抑制曲线回归方程，式中：Y为抑制率（%）；X为农药浓度（μg/L）；A1为检测范围内最低检测浓度禾草丹农药的抑制率（%）；A2为检测范围内最高检测浓度禾草丹的抑制率（%）；P为曲线拐点的斜率；X0为IC50（μg/L）。D=(C1-C2)/C1×100%(3)式中：D为降解率（%）；C1为秸秆中农药残留的初始浓度（mg/L）；C2为菌株降解后秸秆中农药残留的浓度（mg/L）。1.4数据统计与方法试验中所有数据均进行3次平行试验，利用Origin 2019和SPSS对单因素试验、正交试验进行数据处理，数据结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与讨论2.1禾草丹浓度对微生物生长的影响（见表2）由表2可知，禾草丹对细菌、真菌、放线菌均有抑制作用，随着禾草丹浓度增加，3种菌落总数均明显减少。当培养基中禾草丹浓度为0.05 mg/L时，黑河土壤样品中的细菌、放线菌、真菌的数量分别为7.21×106、3.08×106、2.71×106 CFU/g；当禾草丹浓度为0.2 mg/L时，样品中的细菌、放线菌、真菌的数量分别为9.0×105、4.2×105、2.2×105 CFU/g，说明禾草丹浓度的增加抑制了土壤中微生物的生长。在禾草丹浓度相同时，4个地区土壤中宾县样品的细菌、放线菌、真菌3类微生物数量均最多，当禾草丹浓度为0.05 mg/L时，细菌、放线菌、真菌的含量分别为1.064×107、3.87×106、3.21×106 CFU/g，所以宾县土壤有利用禾草丹能力较好的微生物，且3类微生物中细菌菌落数最多。因此，将细菌平板上的菌落进行编号，进一步筛选降解菌株。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.T002表2禾草丹浓度对微生物生长的影响项目禾草丹浓度/(mg/L)土壤样品来源黑河鸡西牡丹江宾县细菌的数量0.0572.1±11.474.3±12.678.1±13.0106.4±10.10.1049.3±7.853.9±4.756.8±6.378.6±12.00.1527.6±4.231.4±2.533.3±1.654.2±6.20.209.0±1.211.2±3.110.8±2.621.5±2.7放线菌的数量0.0530.8±2.334.5±3.135.1±2.638.7±1.80.1016.4±1.717.4±2.518.1±4.420.0±2.40.158.3±3.38.6±3.69.0±2.29.9±1.50.204.2±2.74.4±1.94.5±3.44.7±1.3真菌的数量0.0527.1±1.629.3±2.430.4±3.232.1±1.50.1010.4±2.111.2±1.512.3±2.213.5±3.10.155.4±3.15.6±1.66.0±1.16.3±3.10.202.2±1.42.4±2.12.7±3.23.2±1.6×105 CFU/g2.2培养48 h后各菌株的吸光值（见表3）孔板中农药基本呈透明色，每个菌落用接种针点取时保持菌体量一致。留一排未接种菌落的为对照组（H4~H12为空白组）。由表3可知，孔板中可见C6、D5、D8、E7、F6浑浊度较高，同时吸光值明显升高，吸光值分别为1.152、0.962、0.882、0.936、1.026，与空白组（0.381~0.445）相比有明显的升高。表明该5株菌可以使0.1 mg/L的禾草丹为唯一碳源能生长，具有降解禾草丹的能力。将5株菌挑取到牛肉膏蛋白胨斜面培养，C6、F6生长较快，说明2株菌利用禾草丹的能力较强，所以将C6、F6进行进一步鉴定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.T003表3培养48 h后各菌株的吸光值组别123456789101112A0.4110.4210.4820.4600.4370.3950.4390.7300.4860.4390.5130.463B0.4430.4480.4750.4830.4800.5170.5100.5440.4930.4910.4870.529C0.5120.4930.4440.4280.7351.1520.7400.4290.4730.4470.4950.462D0.5740.7210.5160.5710.9620.6320.8060.8820.5720.4820.5100.455E0.5080.7600.5520.6760.5720.7290.9360.7900.4900.5630.4110.445F0.5060.4900.5150.5100.8031.0260.7880.6210.4760.4800.5830.481G0.5270.6700.4830.5910.4500.4640.4570.5080.5160.4680.5260.504H0.5380.5930.4310.4000.3870.4560.4380.4090.4450.3810.4280.3962.3降解禾草丹菌株C6和F6的鉴定（见图1）挑取单菌落进行革兰氏染色，在10×100倍的光学显微镜下对2株降解菌进行观察。由图1可知，2株菌均为革兰阳性菌，菌株C6的菌落为圆形、呈乳白色、表面轻微凹陷、菌落直径为5 mm，显微镜观察菌体长度为2 μm；菌株F6菌落也为圆形、呈乳白色、表面平坦湿润、菌落直径为2 mm，显微镜观察菌体的长×宽为3 μm×1.3 μm。根据2株菌的大小及形态，可判定菌株C6和F6均为杆菌属（Bacillus）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F001图1菌株C6和F6的菌落特征及革兰氏染色2.4菌株C6和F6的系统进化分析2.4.1菌株PCR扩增产物分析（见图2）进一步对菌株C6与F6进行分子鉴定得到PCR扩增产物，其中M为marker的电泳条带（100~2 000 bp），1和2分别为菌株C6和F6电泳条带。由图2可知，PCR扩增产物约在1 000 bp处有清晰明亮条带且无弥散现象。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F002图2菌株C6和F6的PCR扩增电泳图2.4.2菌株C6和F6的16S rDNA序列分析及系统发育构建（见图3）根据16S rDNA测序结果，菌株C6和F6经过拼接后的序列全长分别为1 091 bp和1 070 bp。将全长序列在NCBI进行Blast比对，菌株C6与阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）、菌株F6与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的同源性分别高达99.35%和98.96%。利用MEGA-X构建系统发育树。由图3可知，菌株C6与模式株Bacillus aryabhattai MT184818.1、Bacillus aryabhattai KU877640.1、Bacillus aryabhattai KU161298.1在同一分支聚为一类且置信度为85%，菌株F6与模式株Bacillus thuringiensis MN84518.1、Bacillus thuringiensis KF836519.1、Bacillus thuringiensis MT706014.1在同一分支聚为一类且置信度为100%。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对细菌形态的描述，结合16S rDNA分子测序结果，鉴定为菌株C6为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），菌株F6为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F003图3菌株C6和F6系统发育树冯玮等[23]从西藏土壤中分离出1株耐辐射的阿氏芽孢杆菌T61，表明其对抗UV辐射能力较强。俞英昉等[24]研究表明，苏云金芽孢杆菌GIM1.150和FJAJ—12均具有杀虫效果，说明2株菌具有良好的抗逆性。陈波[25]研究表明，高剂量苏云金芽孢杆菌对小鼠肾脏有危害；而阿氏芽孢杆菌被列入益生菌行列[26]，为保证菌株在饲料中的使用安全性，进一步选择阿氏芽孢杆菌C6进行对禾草丹降解效率试验。2.5禾草丹的标准抑制曲线（见图4）经计算，曲线方程为y=92-72/（1+x/0.11）0.23，R2=0.957 53。秸秆洗脱液中禾草丹含量为0.12 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F004图4禾草丹农药的标准抑制曲线2.6菌株C6生长条件及禾草丹农药的降解特性2.6.1pH值对菌株C6生长及禾草丹降解效率的影响（见图5）由图5可知，pH值为6.5时，菌株C6生长量的OD600 nm值为1.32；pH值为7.0时，菌株C6对禾草丹的降解率为95.7%，菌株生长的最佳pH值低于农药降解最适pH值，可能因为菌株内降解禾草丹的单加氧酶最适pH值为7.0。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F005图5pH值对菌株C6生长和禾草丹降解效率的影响2.6.2接种量对菌株C6生长及禾草丹降解效率的影响（见图6）由图6可知，随着接种量的增加，菌株生长量和降解效率均呈先上升后下降趋势，当菌株生长的接种量为3%时，OD600 nm值达1.15；当接种量大于3%时，菌株生长量受到抑制，可能因为过多的接种量抑制了菌体的生长繁殖。当接种量为4%时，降解效率为95.8%，接种量大于4%时降解效率降低，可能因为过多的接种量降低了菌株内降解酶活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F006图6接种量对菌株C6生长和禾草丹降解效率的影响2.6.3装液量对菌株C6生长及禾草丹降解效率的影响（见图7）由图7可知，随着装液量的增加，菌株的生长量和降解效率均先上升后下降。当装液量为90 mL时，菌株的生长量OD600 nm值为1.29，降解率为93.2%，证明90 mL装液量时的传氧系数最适宜菌株的生长及降解。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.F007图7装液量对菌株C6生长和禾草丹降解效率的影响2.7菌株C6最佳降解条件正交试验结果与方差分析（见表4、表5）由表4可知，各因素对菌株C6降解率影响的大小依次为C＞B＞A，即装液量＞接种量＞pH值。根据k值可知，优组合为A2B2C2，而从结果可以得出最优组合为A1B2C2，对两组合进行验证试验，A2B2C2组合的降解率为96.1%，最终得出A1B2C2组合最优。从而确定菌株C6的最佳降解条件为：pH值6.5、接种量4%、装液量90 mL，降解率为96.5%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.T004表4菌株C6最佳降解条件正交试验结果试验号ABC空列降解率/%11（6.5）1（3）1（70）166.5212（4）2（90）296.5313（5）3（110）392.142（7.0）12396.35223193.16231266.773（7.5）13292.58321367.29332195.9k185.085.166.885.2k285.485.696.285.2k385.284.992.685.2R0.40.729.4由表5可知，接种量和装液量极显著影响禾草丹的降解率，pH值显著影响禾草丹的降解率，与极差分析结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.017.T005表5方差分析结果方差来源平方和自由度均方F值P值显著性校正模型1 544.633a6257.43977 231.6670.000截距65 331.360165 331.3601.960×1070.000A0.16720.08325.0000.038*B0.78020.390117.0000.008**C1 543.6872771.843231 553.0000.000**误差0.00720.003总计66 876.0009校正的总计1 544.6408注：1.F0.05（2，2）=19，F0.01（2，2）=99。2.*表示差异显著，**表示差异极显著。3结论试验筛选的2株菌分别为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），对菌株C6对秸秆样品的降解率进行研究，确定菌株C6的最佳降解条件为pH值6.5、接种量4%、装液量90 mL，降解率为96.5%。本研究为降解秸秆中禾草丹农药残留提供优良降解菌株，也为保证饲料安全提供有效方法。