水牛乳各种生物活性物质均衡，易被人体吸收，可视为满足人体所需营养的理想食物[1]。德宏奶水牛是以德宏水牛为母本，利用摩拉水牛、尼里-拉菲水牛等种公牛进行杂交改良形成的产乳性能较高的杂交水牛，改良后的德宏奶水牛逐步向乳、肉、役兼用方向发展，其中乳用性能尤为突出[2]。Toll样受体（TLRs）是研究最广泛的模式识别受体（PRRs），可以通过识别配体介导机体的天然免疫和适应性免疫[3]。TLR8作为TLRs的家族成员，主要在单核细胞、巨噬细胞中表达，负责识别核酸。研究表明，TLR8被定位于水牛X染色体上，在免疫组织和器官的表达量相对较高[4]。黄勇等[5]报道，牦牛TLR8在肾脏中表达量最高，在肝、脾、卵巢以及乳腺等组织表达量较高，而在心、肌肉中表达量较低。TLR8在免疫系统中通过促进γ-干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白介素-12（IL-12）的分泌链接天然免疫和适应性免疫，在抗感染、抗肿瘤、抗过敏中发挥关键作用[6]。目前，对牛TLRs的研究主要集中在TLR1、TLR2、TLR4和TLR6，对TLR8的报道较少。因此，本试验研究TLR8基因的表达水平与德宏奶水牛乳脂率的相关性，对TLR8的生物学特征进行分析，为后续探究德宏奶水牛TLR8的功能提供参考。1材料与方法1.1试验材料选取云南省德宏州芒市芒丙村养殖小区中饲养条件相同的健康德宏奶水牛216头，利用乳品分析仪测定乳脂率，以7%~8%为中乳脂率组（M组），高于8%为高乳脂率组（H组），低于7%为低乳脂率组（L组）。每组选择同一胎次、年龄相近、泌乳中期的水牛各3头，屠宰采集乳腺组织，-80 ℃保存，用于总RNA提取。1.2测定指标及方法1.2.1乳脂率采用购自上海技越国际贸易有限公司的Milko ScanTM FT120乳成分分析仪测定乳脂率。1.2.2乳腺组织总RNA的提取及反转录提取9头试验牛乳腺组织总RNA，利用1%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，测定总RNA浓度和纯度，质量较好的RNA反转录成cDNA，-80 ℃保存。1.2.3荧光定量PCR引物设计引物信息见表1。从NCBI获取水牛TLR8（XM_006077059.2）和β-肌动蛋白基因（β-actin gene, ACTB）（XM_006044278）的序列，利用Premier 6.0设计引物，Oligo 7软件评价引物质量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.016.T001表1引物信息基因名称引物序列（5′→3′）扩增片段/bp退火温度/℃TLR8F-GCATTCTACTTGGCCTTGCAR-TCTGCCAAAACAAGCCTTCC17559β-actinF-AAGGACCTCTACGCCAACACGR-TTTGCGGTGGACGATGGAG249601.2.4TLR8基因表达水平利用SYBR® Premix EX Taq™Ⅱ荧光定量试剂以及荧光定量PCR引物，将德宏奶水牛乳腺组织cDNA作为模板进行实时荧光定量反应，同时以β-actin基因为内参进行校正，反应体系20 µL，其中SYBR® Premix Ex Taq™ Ⅱ 10 µL、上下游引物各1 µL、RNase Free dd H2O 7 µL、cDNA模板1 µL。反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行40个循环；55 ℃，30 s，61个循环进行熔解曲线分析。TLR8基因与内参β-actin的组织样品均设置3个重复，根据TLR8及β-actin的Ct值，运用相对Ct法计算德宏奶水牛乳腺组织TLR8基因的相对表达量。1.2.5生物信息学分析根据NCBI提供水牛TLR8的氨基酸序列（XP_006077121.1），使用ProtParam和ProtScale程序分析TLR8的理化性质；使用TMHMM2.0、SignalP3.0、SMART及SOPMA分别预测TLR8的跨膜结构、信号肽、结构域和二级结构；采用STRING和Cytoscape联合构建蛋白的网络互作图，所有网络分析工具参考唐贺贺等[7]的报道。2结果与分析2.1德宏奶水牛乳脂率测定结果（见图1）由图1可知，H组德宏奶水牛的乳脂率极显著高于M组和L组（P0.01），M组显著高于L组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.016.F001图1德宏奶水牛乳脂率测定结果注：大写字母不同表示差异极显著（P0.01），小写字母不同表示差异显著（P0.05）；下图同。2.2德宏奶水牛乳腺RNA定量与检测（见图2）由图2可知，提取9头试验牛乳腺组织总RNA后进行电泳鉴定，得到清晰、完整的条带。RNA浓度大于500 mg/L，OD260/280 nm值在1.8~2.2之间，符合质量要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.016.F002图2德宏奶水牛乳腺组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果注：M为DL-2 000 Marker；1~3为H组；4~6为M组；7~9为L组。2.3德宏奶水牛TLR8基因mRNA表达情况（见图3）由图3可知，L组牛乳腺组织TLR8基因表达水平极显著高于H组和M组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.016.F003图3德宏奶水牛TLR8基因表达水平2.4TLR8基因mRNA表达水平与乳脂率相关分析利用Pearson相关系数法对TLR8基因mRNA表达水平与乳脂率进行相关分析。结果表明，试验牛乳腺组织TLR8基因mRNA表达水平与乳脂率呈显著负相关（P0.05），相关系数为-0.748。2.5水牛TLR8生物信息学分析2.5.1TLR8蛋白的理化性质分析（见图4）由图4可知，水牛TLR8基因编码包含1 033个氨基酸，其中亮氨酸（Leu）最多，占全部氨基酸的15.7%；负电荷及正电荷残基分别为105和89，分子式为C5338H8275N1399O1567S31，分子量为118 kD、等电点5.90、脂肪指数99.49，属于脂溶性蛋白，亲水性平均值为-0.134，不稳定指数为39.06，表明水牛TLR8蛋白稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.016.F004图4水牛TLR8蛋白氨基酸组成2.5.2TLR8疏水性分析（见图5）由图5可知，第900位丝氨酸（Ser）疏水性最弱为-2.400，第968位缬氨酸（Val）疏水性最强为2.911，56.49%的氨基酸在负值区域，推测TLR8为亲水蛋白，该结果与ProtParam程序分析一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.016.F005图5TLR8疏水性分析2.5.3TLR8跨膜结构及信号肽预测（见图6、图7）由图6、图7可知，水牛TLR8蛋白第1-817位氨基酸位于细胞膜表面，第818~840位氨基酸之间存在一个跨膜区。信号肽预测结果发现，TLR8蛋白存在信号肽序列，具体序列为MTLRFLLLTSLFLLISDS，剪切位点最可能在第18和第19位氨基酸之间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.016.F006图6TLR8跨膜结构预测10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.016.F007图7TLR8信号肽预测2.5.4TLR8亚细胞定位运用PSORTⅡ预测TLR8蛋白或表达产物的分布，结果表明，TLR8主要在内质网（44.4%）、高尔基（22.2%）、细胞膜（11.1%）中发挥作用。2.5.5TLR8结构域和二级结构预测（见图8、图9）由图8、图9可知，水牛TLR8的胞外区含有12个LRR、3个LRR_TYP和1个LRR_CT，胞内区具有1个TIR功能结构域。二级结构中α-螺旋占比最大（43.47%）；无规则卷曲次之（37.08%）；延伸链（14.62%）；β-转角占比最小（4.84%）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.016.F008图8TLR8结构域预测10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.016.F009图9TLR8二级结构预测注：h表示α-螺旋，c表示无规则卷曲，e表示延伸链，t表示β-转角。2.5.6TLR8蛋白互作网络（见图10）由图10可知，水牛TLR8可能与10个蛋白存在互作，包括TRAF6、IRAK1、IRAK4、MYD88、IRF7、LY86和UNC93B1等蛋白，其中TLR8与MYD88、IRAK1、IRAK4、IRF7及TRAF6互作较为紧密，说明TLR8的免疫应答需要依赖性MYD88信号传导途径的介导。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.016.F010图10TLR8蛋白互作网络3讨论TLRs可以识别病原（PAMPs），激活天然免疫系统，引起促炎反应[8]。TLR8与TLR7高度同源，负责识别病毒的ssRNA。TLR8参与化脓性细菌的识别，是革兰氏阳性化脓菌的主要传感器，但对革兰氏阴性菌的识别能力较弱[9]。章纬菁[10]发现，家牛经TLR8的人工合成配体瑞奎莫德刺激后，机体中的核转录因子-κB（NF-κB）和白介素-8（IL-8）的表达水平比对照组高3倍，TLR8与配体结合可以刺激MYD88活化，招募IRAK，促进下游转录因子NF-κB的合成及细胞因子转录表达。郭振刚等[11]研究表明，TLR8对机体抵御感染至关重要，在各物种进化过程中高度保守，TLR8基因在水牛、黄牛、绵羊和山羊等物种的同源性均高于97%。本试验中，水牛TLR8的结构特征与TLR家族相符，在体内可以与PAMPs结合，发挥信号转导的作用。TLR8蛋白主要与MYD88、IRAK1及TRAF6形成互作关系，MYD88是TLR启动免疫应答的关键接头蛋白，IRAK和TRAF6负责激活转录因子，而IRF诱导下游免疫相关基因的转录及表达，表明TLR8的信号转导通过依赖性MYD88信号传递途径完成，该结果与Fitzgerald等[12]研究结果一致。由此推测，水牛TLR8可能参与体内的免疫防御反应。TLR8通过识别PAMPs触发TLR8-MyD88-IRAK4信号活化途径，激活抗病毒反应，抑制辅助性T细胞的功能，增强机体的抗肿瘤及抗感染免疫应答[13]。Thada[14]研究表明，TLR8与TLR4可以形成异源二聚体，诱导NF-κB和IRF3的应答，参与结核分枝杆菌的识别，说明TLR8和TLR4相互作用在结核病的治疗和疫苗开发中具有潜在意义。朱亚军[15]研究表明，与正常组相比，高脂血症、糖调节受损以及2型糖尿病人群外周血单核细胞中TLR8的表达水平显著升高；利用高脂饮食诱导胰岛素抵抗及对TLR8进行药物干预发现，高脂组和药物干预组大鼠骨骼肌TLR8的表达发生明显变化，表明TLR8与胰岛素抵抗密切相关。肖媛媛[16]研究发现，哈萨克羊TLR8基因突变组对绵羊肺腺瘤病毒的易感性强于对照组，表明TLR8基因单核苷酸多态性位点突变可能致使机体的免疫应答受阻，影响对病毒感染后的免疫调节反应。本研究发现，TLR8在不同乳脂率组德宏奶水牛乳腺组织中均表达，且L组的表达量最高，TLR8基因的表达水平与乳脂率呈显著负相关。目前，关于TLR8对乳脂率的影响未见报道，其与乳脂合成的关系尚需进一步研究。4结论水牛TLR8蛋白的结构特征与TLR家族相符；TLR8基因在德宏奶水牛乳腺组织的表达水平与乳脂率呈负相关，该结果可为免疫相关基因与乳脂合成的研究提供参考。