纤维素材料是世界上最丰富的可再生资源，自然界中含量最丰富的有机碳水化合物[1-3]。纤维素材料的降解与循环利用是实现碳循环的重要途径[4]。因此，需要合理开发和科学利用纤维素材料。随着能量的损耗逐渐增加，碳资源的合理利用受到重视[5]。将纤维素类物质转变成人类所需的物质意义重大。目前，酒糟、麸皮、秸秆等富含纤维的农业废弃资源的开发与利用较为广泛，但对纤维丰富的红薯秧、甜瓜秧、南瓜秧及落叶资源的利用较低。降解纤维素类物质的方法很多，但均存在一定的弊端。纤维素酶是微生物产生的细胞外酶，可以在有效降解纤维原料时降低对环境的危害[6]。能够产生纤维素酶的微生物种类较多。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，具有发酵周期短、嗜温、好氧等多种生理特性[7-9]。枯草芽孢杆菌可以产生多种酶，如纤维素酶、蛋白酶、α-淀粉酶和木聚糖酶等[10]。蛋白质工程和基因工程等高新技术的推广应用，使枯草芽孢杆菌在短期内产生大量新型酶类成为可能[11-12]。本试验对枯草芽孢杆菌产纤维素酶条件进行研究，从碳源种类、装液量、碳源添加量、培养温度等方面进行优化，为放大生产及后续的应用研究提供参考。1材料与方法1.1试验菌株枯草芽孢杆菌由河北省水产养殖微生物菌剂技术创新中心提供。1.2材料与药品杨树叶采自校园；酒糟、红薯秧、麸皮，购自灵寿县宝岳矿产品加工厂。蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、葡萄糖、羧甲基纤维素钠、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、3,5-二硝基水杨酸（分析纯）、酒石酸钾钠、苯酚（分析纯）、无水亚硫酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、新华一号滤纸，均由沧州建新化工生物有限公司提供。斜面培养基[13]：CMC-Na 5.0 g、NH4Cl 1.0 g、酵母膏1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4 1.0 g、琼脂15.0 g、水1 000 mL，115 ℃灭菌30 min。筛选培养基[14]：蛋白胨1 g、酵母膏0.5 g、NaCl 1 g、KH2PO4 0.1 g、MgSO4 0.02 g、琼脂0.2 g、蒸馏水100 mL，pH值自然。种子培养基：蛋白胨4 g/L、酵母膏2 g/L、NaCl 10 g/L，pH值自然，121 ℃灭菌30 min。发酵培养基[15]：酒糟、红薯秧、杨树叶、麸皮、蛋白胨10.0 g/L、K2HPO4 6.0 g/L、KH2PO4 3.0 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、豆饼粉5.0 g/L、酵母膏0.4 g/L，pH值自然，121 ℃灭菌30 min。1.3试验方法1.3.1菌种培养菌种活化：将冷冻菌株接种至斜面培养基，37 ℃培养16~20 h。菌种扩培：从斜面培养基中勾取活化好的生长状况良好的枯草芽孢杆菌，在菌种筛选平板培养基上进行划线，恒温培养箱中37 ℃培养16~20 h。种子制备：无菌前提下，勾取1~2环已活化的生长状况良好枯草芽孢杆菌菌种，接种在含有100 mL液体的种子培养基，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h。1.3.2单因素试验设计分别选取碳源（酒糟、红薯秧、杨树叶、麸皮）、碳源添加量（3、5、7、9、11、13 g/L）、装液量（25、50、75、100、125、150 mL）、产酶温度（16、23、30、37、44、51 ℃）作为考察因素，以CMCA酶活为指标考察以上因素的合适范围。1.3.3响应面试验设计综合单因素试验的结果，利用Design-Expert 8.0.7.1中与响应面分析相关的部分，根据Box-Behnken设计原理，选取装液量、产酶温度、碳源添加量3个影响因素设计响应面，响应面因素与水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.T001表1响应面试验因素与水平设计水平A装液量/mLB产酶温度/℃C碳源添加量/(g/L)-175305010037711254491.4纤维素酶活力的测定及计算羧甲基纤维素酶活力（CMCA）：1 g固体酶（或1 mL液体酶）在（50±0.1）℃，指定pH值条件下（酸性纤维素酶pH值4.8，中性纤维素酶pH值6.0），1 h纤维素酶水解相应的底物以产生相当于1 mg葡萄糖的还原糖，定义为1个酶活力单位，表示为U/g（或U/mL）。粗酶液的获得：取出经过发酵培养的250 mL锥形瓶，将培养液倒入离心管中，4 800 r/min离心15 min，取上清液作为粗酶溶液。葡萄糖标准曲线的绘制：见参考文献[16]。酶活力测定及计算：见参考文献[17-19]。2结果与分析培养基初始pH值的变化不易控制，枯草芽孢杆菌产生的纤维素酶对pH值敏感。因此，在确定氮源为蛋白胨与酵母膏的混合物、培养基初始pH值为7、培养时间为48 h、菌种接种量为4%等的前提下，对装液量，产酶温度和碳源添加量进行单因素和响应面优化。2.1单因素试验结果2.1.1碳源种类对菌株产纤维素酶活力的影响（见图1）由图1可知，杨树叶作为碳源时，产纤维素酶活较高。因此，确定杨树叶为最佳碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.F001图1碳源种类对菌株产纤维素酶活力的影响2.1.2碳源添加量对菌株产纤维素酶活力的影响（见图2）由图2可知，随着碳源添加量逐渐增多，酶活呈现上升趋势，后逐渐下降，当碳源添加量为7 g/L时，酶活最高。因此，选取5、7、9 g/L为后期响应面的分析参数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.F002图2碳源添加量对菌株产纤维素酶活力的影响2.1.3装液量对菌株产纤维素酶活力的影响（见图3）以杨树叶为碳源、碳源添加量为7 g/L。由图3可知，随着装液量的增加，酶活呈现先增大后下降的趋势。因此，选取75、100、125 mL作为后期响应面分析的参数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.F003图3装液量对菌株产纤维素酶活力的影响2.1.4温度对菌株产纤维素酶的影响（见图4）以杨树叶为碳源、碳源添加量为7 g/L、装液量为100 mL。由图4可知，随着温度的增加，酶活呈现先增大后下降的趋势。因此，选取30、37、44 ℃为后期响应面分析的参数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.F004图4温度对菌株产纤维素酶活力的影响2.2响应面试验与数据回归分析（见表2）使用Box-Benhnken原理，对影响枯草芽孢杆菌产生纤维素酶的3个因素进行17组试验。使用Design- Expert 8.0.7.1软件对从响应面获得的测试数据进行多变量回归拟合，并将装液量、产酶温度和碳源添加量作为独立变量，CMCA活力作为响应值（y）。y=3.66+0.033 4A-0.000 6B+0.049 8C-0.008 5AB+0.034 3 AC-0.057 2BC-0.839 9A2-1.01B2-1.03C2 (R2=0.897 5)(1)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.T002表2响应面试验结果项目A装液量/mLB产酶温度/℃C源添加量/(g/L)纤维素酶活力/(U/mL)11003051.48821254471.88831003773.15441004451.5135753071.7256754471.82971003773.70181003774.65291003773.224101004491.644111253791.82912753751.818131003091.848141253071.818151003773.57316753791.703171253751.8072.3回归方程显著性检验以纤维素酶活力为指标的产纤维素酶发酵条件响应面模型和回归系列显著性检验见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.T003表3响应面试验方差分析方差来源平方和自由度均方F值P值显著性R2=0.897 5，C.V.=20.05%，AP=6.04 30模型13.1291.466.810.009 6A0.008 910.008 90.041 60.844 1B3.12 5×10-613.125×10-60.000 00.997 1C0.019 810.019 80.092 50.769 8AB0.000 310.000 30.001 40.971 7AC0.004 710.004 70.021 90.886 5BC0.013 110.013 10.061 30.811 6A22.9712.9713.880.007 4**B24.2614.2619.910.002 9**C24.4814.4820.940.002 6**残差1.5070.214 0失拟项0.058 430.019 50.054 10.981 2不显著纯误差1.4440.359 9总值14.6216注：*表示影响显著（P0.05），**表示影响极显著（P0.01）。由表3可知，回归模型显著（P0.05），失拟项不显著（P0.05），表明该方程合理可行。模型决定系数差值小于0.2，说明该模型拟合程度较高，测试误差相对较小。变异系数（C.V.）为20.05%，说明模型离散程度小。信噪比（AP）反应外部干扰对试验模型的影响程度，表明模型受干扰程度小（AP4）。由表3可知，模型方程一次项中3种因素对纤维素酶活力的影响主次顺序依次为CAB，但是P值大于0.05表明各因素对原模型影响不显著；交互项P值大于0.05表明因素间对模型不存在交互影响；二次项A2、B2、C2的P值均小于0.01，具有极高的显著性，说明产纤维素酶的条件相对复杂，该因素对纤维素酶活力的影响不是简单的线性关系，响应面效应显著。纤维素酶活力优化模型的正态残差见图5。由图5可知，残差的正态概率数据点基本在一条直线，残差符合正态分布的条件，表明该试验优化的条件可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.F005图5纤维素酶活力优化模型的正态残差3个因素对纤维素酶活力的交互影响的响应面分析见图6~图8。由图6~图8可知，响应面立体的最高点，对应产酶量的最大值，该最高点所对应的坐标值即为菌株产酶量最大时各因素的取值。经软件分析可知，各因素分别为装液量100.510 mL、产酶温度36.995 ℃、碳源添加量7.049 g/L，所得最大酶活力为3.662 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.F006图6装液量与产酶温度对产纤维素酶活力的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.F007图7装液量与碳源添加量对产纤维素酶活力的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.F008图8产酶温度和碳源添加量对产纤维素酶活力的影响2.4响应面模型拟合与试验验证（见表4）验证优化模型下的预测值与试验结果相符性。选取装液量为101 mL、产酶温度为37 ℃、碳源添加量为7 g/L，其他因素不变，试验验证设计与结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.019.T004表4试验验证设计与结果组别A/mLB/℃C/(g/L)酶活力/(U/mL)11013773.66621013773.38831013774.015由表4可知，该菌株产生的纤维素酶活力为3.690 U/mL。与响应面优化模型的预测值3.662 U/mL接近，误差为0.75%，说明选择的响应面优化模型可以较好地对优化条件下枯草芽孢杆菌发酵所产生的纤维素酶活力进行预测。3结论本试验条件下，在装液量101 mL、产酶温度37 ℃、碳源添加量7 g/L时，枯草芽孢杆菌产纤维素酶的活力最高为3.662 U/mL，较未优化前酶活力有所提高。