西藏的气候和自然环境具有极端性和不稳定性，每年冬寒期长达7个月，导致西藏地区牧草的生长水平极低，饲草料资源短缺，严重阻碍西藏畜牧业的发展[1-2]。油菜是1种抗寒力极强的作物，具有生物产量高、粗蛋白质含量高等特点[3]。油菜的蛋白质含量比小麦、玉米高3~4倍，比稻米高3~5倍[4-5]，脂肪酸和氨基酸的成分较为平衡[6]。因此，油菜植株可以用作优良的青绿饲料和青贮原料，是1种优质的粗饲料资源。三叶草属于豆科植物，蛋白质含量相对较高。三叶草质地柔软，细嫩多汁[7]。三叶草分布广、适应性强、耐寒性强，可以在西藏地区生长。三叶草的粗蛋白含量高，富含黄酮类化合物、钙、钾、镁、磷、维生素、烟酸等多种营养成分，是草食反刍家畜很好的粗饲料[8-9]。王洪壮等[10]对三叶草和油菜混合青贮饲料的发酵品质进行研究，但并未进行体外发酵效果研究。因此，本研究利用体外发酵法，使用牦牛和藏羊瘤胃液对不同比例的油菜与三叶草混合青贮饲料进行体外发酵试验，为西藏地区牦牛、藏羊的饲草料资源开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料6只健康体重相近的成年牦牛和4只健康体重相近的成年藏羊，选自西藏林芝市巴宜区八一镇冬如村牛羊定点屠宰场。清晨饲喂前，屠宰牦牛和藏羊，取牦牛瘤胃食糜，将6头牦牛瘤胃液混合，四层医用纱布过滤至保温壶中，同样的方法收集4头藏羊瘤胃液，带回试验室备用。油菜和三叶草采自西藏林芝西藏农牧学院实习牧场，利用铡刀将两种牧草切成约2~3 cm，将油菜和三叶草以不同比例混合青贮，依次为全油菜青贮（Y100%组）、油菜∶三叶草=4∶1混合青贮（Y80%S20%组）、油菜∶三叶草=3∶2混合青贮（Y60%S40%组）、油菜∶三叶草=2∶3混合青贮（Y40%S60%组），将上述不同比例的混合青贮装于小型塑料青贮罐子内，压缩，密封，青贮。青贮第30 d打开青贮窖，取出青贮饲料，烘干，粉碎，测定每组青贮饲料的营养成分。油菜与三叶草混合青贮饲料青贮30 d后的营养成分见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.003.T001表1油菜与三叶草混合青贮饲料青贮30 d后的营养成分组别干物质/(g/kg FW)粗蛋白质/(g/kg DM)中性洗涤纤维/%酸性洗涤纤维/%Y100%组185.92167.5252.529.62Y80%S20%组204.48175.8256.9110.89Y60%S40%组234.89194.3153.6011.55Y40%S60%组241.64210.5268.5910.991.2试验设计利用牦牛、藏羊瘤胃液分别对青贮30 d的Y100%组、Y80%S20%组、Y60%S40%组、Y40%S60%组青贮饲料进行体外发酵，每组3个重复，评定每组青贮饲料体外发酵效果。1.3体外试验采用Menke等[11]的方法配制人工瘤胃营养液，将牦牛瘤胃液和藏羊瘤胃液加入预热至39 ℃的容器中，按照1∶2的体积比，将牦牛或藏羊瘤胃液与人工瘤胃营养液混合均匀。将混合后的瘤胃液加热并通入CO2；在玻璃培养管中加入30 mL发酵液，排尽空气，夹住橡胶管，记录刻度值。利用水浴箱培养48 h，记录产气量。体外发酵结束，取出发酵液，测定pH值。发酵液离心，测定上清液中挥发性脂肪酸含量，使用沉淀测定营养物质降解率。1.4测定指标及方法使用HANNA-pH 211精密pH计（意大利HANNA公司）测定发酵后液体的pH值；参照《饲料分析及饲料质量检测技术》中的方法测定干物质、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维的降解率；采用高效气相色谱仪测定挥发性脂肪酸含量。1.5数据统计与分析使用Excel软件进行数据整理，使用SPSS 22软件对试验数据进行单因素ANOVA分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同比例青贮的营养物质降解率及pH值（见表2、表3）由表2可知，牦牛瘤胃液对混合青贮体外发酵后，Y40%S60%组青贮的干物质、中酸性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的降解率显著高于其他3组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.003.T002表2牦牛瘤胃液体外发酵后混合青贮饲料的营养物质降解率及pH值组别干物质/%中性洗涤纤维/%酸性洗涤纤维/%pH值Y100%组31.13±1.83a24.06±2.94a1.24±0.25a6.86±0.89Y80%S20%组36.79±1.66b29.42±1.29b2.85±0.43c6.89±0.32Y60%S40%组40.73±1.91c28.67±0.78b2.01±0.30b6.86±0.13Y40%S60%组47.21±2.01d43.18±2.16c4.97±0.34d6.79±0.57注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。由表3可知，藏羊瘤胃液对混合青贮体外发酵后，Y40%S60%组青贮的干物质降解率显著高于Y60%S40%组（P0.05），中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的降解率显著高于其他3组（P0.05）。Y60%S40%组青贮的体外发酵液的pH值显著高于其他3组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.003.T003表3藏羊瘤胃液体外发酵后混合青贮饲料的营养物质降解率及pH值组别干物质/%中性洗涤纤维/%酸性洗涤纤维/%pH值Y100%组40.30±0.74ab27.15±0.56a1.83±0.07a6.83±0.17aY80%S20%组41.89±1.04ab28.72±1.23a3.55±0.31b6.86±0.10aY60%S40%组37.88±1.23a30.32±1.68a3.80±0.28b6.99±0.60bY40%S60%组43.88±4.05b42.10±3.02b4.18±0.22c6.87±0.10a2.2不同比例青贮发酵液中挥发性脂肪酸的含量（见表4、表5）由表4可知，牦牛瘤胃液对混合青贮体外发酵后，Y40%S60%青贮组发酵液中乙酸含量显著高于Y60%S40%青贮组（P0.05），丙酸含量显著高于其他3组（P0.05）；Y100%和Y40%S60%组青贮发酵液中丁酸含量和总挥发性脂肪酸含量显著高于其他2组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.003.T004表4牦牛瘤胃液体外发酵后各青贮组发酵液中挥发性脂肪酸的含量组别乙酸/(g/kg DM)丙酸/(g/kg DM)丁酸/(g/kg DM)总挥发性脂肪酸/(g/kg DM)乙酸/丙酸Y100%组96.14±0.47ab33.78±1.04a23.89±3.01b233.44±3.47c2.86±0.41Y80%S20%组95.33±3.80ab33.75±1.61a15.19±1.21a198.96±1.60a2.82±0.25Y60%S40%组92.80±5.55a34.76±3.70a14.09±3.18a194.69±6.84a2.78±0.29Y40%S60%组101.82±4.47b39.14±1.58b20.29±2.61b220.16±5.67b2.60±0.55由表5可知，藏羊瘤胃液对混合青贮体外发酵后，Y60%S40%混合青贮饲料发酵液中的乙酸含量显著高于Y100%和Y80%S20%组（P0.05）。Y40%S60%组青贮发酵液中丙酸含量显著高于Y100%和Y60%S40%组（P0.05）。Y80%S20%组混合青贮饲料发酵液中的丁酸含量显著低于Y100%组（P0.05），总挥发性脂肪酸含量显著低于其他3组（P0.05）。Y40%S60%组混合青贮饲料发酵液中乙酸和丙酸的比值显著低于Y100%组和Y60%S40%组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.003.T005表5藏羊瘤胃液体外发酵后各青贮组发酵液中挥发性脂肪酸的含量项目乙酸(g/kg DM)丙酸(g/kg DM)丁酸(g/kg DM)总挥发性脂肪酸(g/kg DM)乙酸/丙酸Y100%组107.39±0.25a41.14±0.03a41.38±0.60b290.47±0.30c2.61±0.14bY80%S20%组107.13±1.65a45.80±2.42ab27.25±10.60a235.28±14.52a2.34±0.15aY60%S40%组111.34±0.65b41.61±2.11a29.22±1.94ab256.02±3.28b2.67±0.15bY40%S60%组110.60±2.88ab49.58±+3.26b35.32±4.81ab277.79±7.64c2.23±0.89a2.3不同比例青贮的体外发酵48 h产气量变化情况（见图1、图2）由图1可知，利用牦牛瘤胃液发酵混合青贮过程中，随着混合青贮饲料中三叶草含量的增加，产气速率和产气量也逐渐增加。48 h内Y100%组的产气量最低，为35.2 mL；Y40%S60%组的产气量最高，为44.0 mL。其中，12 h内各组的产气速率较快，12~24 h产气速率逐渐下降，24~48 h基本停止产气。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.003.F001图1牦牛瘤胃液对青贮饲料体外发酵48 h累计产气量由图2可知，利用藏羊瘤胃液发酵混合青贮过程中，Y40%S60%组和Y80%S20%组的产气速率和产气量高于Y60%S40%组和Y100%组。48 h内，Y60%S40%青贮组产气量最低，为28.0 mL；Y40%S60%组产气量最高，为60.4 mL，且各组在36 h时基本停止产气。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.003.F002图2藏羊瘤胃液对青贮饲料体外发酵48 h累计产气量对比牦牛瘤胃液和藏羊瘤胃液对混合青贮发酵的产气量情况可知，Y40%S60%组青贮在两种瘤胃液中的产气量均最高，在藏羊瘤胃液中的产气量高于牦牛；Y100%组和Y80%S20%组青贮在藏羊瘤胃液中的产气量高于牦牛，但Y60%S40%组青贮在藏羊瘤胃液中的产气量低于牦牛。3讨论西藏地区自然气候条件恶劣，牧草生长期短、生产水平低，难以为家畜提供充足的饲草资源[12-13]。将农区富余的农作物秸秆调制成优质青贮饲料，探索开发利用农作物秸秆资源，增加饲料来源，对解决西藏地区饲草料资源短缺问题具有重要意义。采用青贮的方法保存饲料可以减少饲料的营养损失，提高饲料的营养价值，有效解决西藏地区冬春季饲草料短缺问题[14-16]。研究表明，青贮天数会影响油菜和三叶草混合青贮饲料的发酵品质，油菜和三叶草混合青贮饲料发酵30 d后，其干物质、水溶性碳水化合物和粗蛋白含量较高，发酵品质较好[10]。因此，本研究选择油菜和三叶草混合青贮30 d的饲料进行体外发酵。反刍动物瘤胃液的pH值是评估瘤胃发酵功能的重要指标，可以反映瘤胃微生物和有机酸的产生、中和、吸收以及排泄的情况。正常情况下，瘤胃液的pH值为5.0~7.5，瘤胃的内环境可以很好地降解营养物质[17]。本研究中，各试验组的瘤胃液pH值为6.79~6.99，均在此范围内。研究表明，随着混合青贮饲料中三叶草比例的增加，牦牛和藏羊对Y100%青贮3种营养物质的降解率最低，但对Y40%S60%混合青贮3种营养物质的降解率最高，但所有青贮组营养物质的降解率均不足50%，可能与混合青贮饲料中较多的三叶草可以改善饲料的发酵品质以及给反刍动物饲喂低质粗粮，会使其瘤胃微生物的活性降低，影响营养物质的降解率有关[18]。乙酸和丙酸的比值代表瘤胃的发酵模式。青贮过程中乙酸产生的主要方式为异型乳酸发酵产生和乳酸异化[19-20]。饲料中中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量越高，瘤胃乳酸的发酵功能越强[21]。本研究中，随着混合青贮饲料中三叶草比例的增加，瘤胃发酵液中的乙酸含量增加，可能与混合青贮饲料中三叶草比例的增加，导致混合青贮饲料中中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的消化率升高有关。反刍动物采食越多的粗饲料，其瘤胃内挥发性脂肪酸中的乙酸比例越高，相反采食越多的精饲料，其瘤胃内挥发性脂肪酸中的丙酸比例越高，而乙酸比例越少[22]。正常情况下，反刍动物瘤胃内乙酸与丙酸的比例应大于2.2∶1[23]。而在本研究中，牦牛和藏羊瘤胃液发酵后，其发酵液中的乙酸含量均高于丙酸，且各混合青贮组发酵液中乙酸和丙酸的比例均高于2.2∶1，表明油菜和三叶草混合青贮饲料适宜饲喂牦牛和藏羊。挥发性脂肪酸是碳水化合物在反刍动物瘤胃中的终产物，可以提供70%~80%的可消化能。张勇等[24]认为，挥发性脂肪酸的含量越高，饲草料可提供的能量越高。本研究中，Y100%组和Y40%S60%组发酵液中的挥发性脂肪酸较高。因此，Y100%和Y40%S60%组混合青贮饲料能够为牦牛和藏羊提供组更多的能量。Maherisis等[25]研究表明，饲粮中中性洗涤纤维的含量与体外发酵产气量呈负相关。但本研究表明，混合青贮饲料中干物质降解率越高，体外发酵产气量越高。Y40%S60%混合青贮饲料中干物质降解率最高，产气量也最高。本研究表明，Y40%S60%混合青贮饲料最适合饲喂牦牛和藏羊。4结论牦牛和藏羊瘤胃液对油菜和三叶草以2∶3的比例混合青贮饲料的降解效果最好。