环境内分泌干扰物(EEDs)通过环境进入生物体或者人体，会对其生殖系统、神经系统、免疫系统等功能产生影响，是目前人们重点关注的物质[1]。双酚类化合物、辛基酚、壬基酚等酚类化合物是重要的工业原料，常用于塑料制品的添加剂，以改善材料的性能。但这些酚类化合物多数对生物体或人体具有潜在危害[2-3]。如双酚A的动物实验表明，其能够使动物产生雌性早熟、精子下降等情况，并且会增加卵巢癌和前列腺癌的发病率。四氯双酚A对哺乳动物具有慢性的内分泌干扰作用，具有神经毒性和免疫毒性等危害。壬基酚是世界公认的环境激素，进入水体会对水生生物具有极大危害[4-6]。我国《食品安全国家标准食品接触材料及制品用添加剂使用标准》（GB 9658—2016）中对双酚A的使用进行限制[7]。2018年欧盟也将壬基酚、双酚类化合物列入高度关注物质清单，且对消费品的酚类化合物含量进行要求[3]。食品包装材料，因其与食品长期直接接触，也被称为“特殊的食品添加剂”[8]。大多数食品包装材料采用塑料制品，因此，材料中酚类化合物含量的检测对食品安全具有重要意义。本实验建立食品塑料包装材料中6种常见酚类化合物的检测方法，通过高效液相色谱-三重串联四级杆质谱仪进行定性定量检测，确保检测结果准确可靠。1实验部分1.1主要试剂甲醇、环己烷、丙酮，色谱纯，上海迈瑞尔科学技术有限公司；二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、乙腈，色谱纯，德国默克公司；6种标准品双酚A(BPA)、双酚B(BPB)、双酚F(BPF)、四氯双酚A(TCBPA)、辛基酚(OP)、4-壬基酚(4-NP)，纯度97%，美国西格玛公司。1.2仪器与设备高效液相色谱-三重串联四级杆质谱仪，6460C，安捷伦科技有限公司；Eclipse Plus C18色谱柱，2.1 mm×150 mm×5 μm，安捷伦科技有限公司；浓缩仪，AYAN-DC60S，杭州安研仪器制造股份有限公司；氮吹仪，AYAN-DC16G，杭州安研仪器制造股份有限公司。1.3标准溶液配制6种酚类化合物分别利用甲醇溶液制成10 mg/L的单标储备液，安瓿瓶密封，-20 ℃保存。配制1 mg/L甲醇的混合标准储备液，密封-4 ℃保存，使用时根据需要稀释至目标浓度。1.4样品前处理取食品塑料包装材料，清洗表面食物残渣，利用纯净水清洗，常温下自然晾干，裁剪至0.3 mm×0.3 mm的碎片。称取样品0.5 g，精确至0.001 g。加入20 mL混合溶剂（含萃取溶剂和溶胀剂），超声振荡25 min。常温、避光，放置3 h。将溶液与样品转移至离心管，1 500 r/min转速下离心，取上清液15 mL浓缩至近干，利用甲醇定容至1 mL，采用0.22 μm滤膜过滤，待高效液相色谱检测。1.5仪器条件1.5.1色谱条件C18液相色谱柱，2.1 mm×150 mm×5 μm，流动相速率恒定为0.5 mL/min，柱温恒定为40 ℃，进样量为10 μL。流动相为两相配比，A相为V(甲醇)∶V(乙腈)=2∶3的混合溶液，B相为4.5 mmoL乙酸铵溶液。初始配比V(A)∶V(B)=25∶75。当A相占比增加，B相减少，5 min后，A相占比达到80%，B相占比减至20%；维持该配比不变至8 min时，A相占比开始减少，B相占比增加；至10 min时，两相恢复至初始比例V(A)∶V(B)=25∶75，直至洗脱程序结束。1.5.2质谱条件电离源：电喷雾负离子模式(ESI-)；检测方式：多反应监测扫描模式(MRM)；雾化器压力：315 kPa，喷嘴电压：0.5 kV，毛细管电压：3.6 kV；鞘气流速：15 L/min，鞘气温度：230 ℃；检测温度：300 ℃。表1为6种酚类化合物的质谱参数，图1为6种酚类化合物的色谱图。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.09.019.T001表16种酚类化合物的ESI-MS/MS质谱参数Tab.1ESI-MS/MS parameters of 6 phenolic compounds化合物母离子（m/z）子离子（m/z）去簇电压/V碰撞电压/VBPA227.1133.0-80-35BPB241211-70-39BPF199.093-92-29TCBPA364.9314-90-31OP205.2132.9-80-304-NP219.1133.2-80-4310.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.09.019.F001图16种酚类化合物色谱图Fig.1Chromatograms of six phenolic compounds2结果与讨论2.1提取条件的优化2.1.1提取溶剂的选择溶剂对6种酚类的溶解性影响提取溶剂的选择。依据6种酚类物质的极性，选择甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷4种溶剂进行探究。图2为4种溶剂对6种酚类化合物的提取效率。从图2可以看出，二氯甲烷的提取效率最差；乙酸乙酯对于TCBPA、OP、4-NP具有较好的提取效率，但是对BPA、BPB、BPF的提取效率不佳；甲醇对6种酚类都具有较好提取效率。这是因为6种酚类化合物是弱极性化合物，根据相似相容原理，与其极性越相近的溶剂萃取效果越好。4种萃取溶剂中，极性最强的丙酮、极性最弱的二氯甲烷对6种化合物的萃取效果较差；而极性居中的甲醇和乙酸乙酯的萃取效果相对较好，乙酸乙酯对于6种酚类的萃取效率均高于80%，甲醇对于6种酚类化合物的萃取效率均大于90%，因此甲醇为最佳提取溶剂。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.09.019.F002图2不同溶剂对6种酚类化合物的提取效率Fig.2Extraction efficiency of six phenolic compounds by different solvents2.1.2提取液中溶胀剂的选择食品用塑料包装材料微观结构致密，分子间相互作用力强，外部溶液不易对其进行浸润，不利于提取目标物。因此，萃取溶剂中不仅需要对样品溶解性强的提取溶剂，还需要能够对聚合物样品具有较好溶胀效果的溶胀剂，才能够顺利萃取目标物。图3为选择环己烷、正己烷、水分别与甲醇以一定比例混合，探究不同溶胀剂对提取效率的影响。从图3可以看出，水作为溶胀剂效果较差，环己烷和正己烷对于聚合物的溶胀效果优于水。溶胀效果最好的是环己烷。因此，环己烷为最佳的溶胀剂。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.09.019.F003图3不同溶胀剂对提取效率的影响Fig.3Effect of different swelling agents on extraction efficiency2.1.3提取液中溶胀剂体积比的选择图4为环己烷不同体积比对6种酚类化合物的回收率的影响。从图4可以看出，随着环己烷体积比增加，回收率呈现先上升后下降的趋势，当体积比为30%，6种酚类化合物的提取效果最好。这是因为当溶胀剂体积比小于30%时，样品基质通道随着溶胀剂的增加而逐渐打开，酚类化合物能够与提取剂甲醇溶解，提升提取效果。当环己烷的体积比大于30%时，溶胀剂开始溶解聚合物样品，聚合物内部的结构框架发生坍塌，导致酚类化合物反被包裹于结构变形的聚合物中，难以被提取剂溶解，回收率下降。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.09.019.F004图4不同体积比溶胀剂对提取效率的影响Fig.4Effect of different volume ratio of swelling agent on extraction efficiency2.2超声提取条件的优化图5为回收率随着超声提取时间变化的曲线。从图5可以看出，10~25 min范围内，回收率随超声提取时间的增加而快速增加；超过25 min，回收率变化趋于平稳。因此，最佳超声提取时间为25 min。图6为6种酚类化合物的回收率随静置时间的变化曲线。从图6可以看出，随着静置时间的增加，提取溶剂对化合物的溶解逐渐增加，3 h后回收率增加不明显，提取溶剂对6种酚类化合物完全溶解。因此，最佳超声提取后静置时间为3 h。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.09.019.F005图5超声提取时间对提取效率的影响Fig.5Effect of ultrasonic extraction time on extraction efficiency10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.09.019.F006图6超声提取后静置时间对回收率的影响Fig.6Effect of standing time on recovery rate after ultrasonic extraction2.3线性范围和检出限表2为6种酚类化合物的线性方程、相关系数R2及检出限。从表2可以看出，6种酚类化合物的R2均大于0.997，说明在1~25 mg/L浓度范围内，6种酚类化合物的仪器响应值与对应的浓度间具有较好的线性相关性。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.09.019.T002表26种酚类化合物的线性方程、相关系数和检出限Tab.2Linear equations， correlation coefficients and detection limits of six phenolic compounds酚类化合物浓度范围/（mg·L-1）线性方程R2检出限/（mg·kg-1）BPA1~25y=9650.6x+11650.99980.058BPBy=9740.7x+20650.99870.064BPFy=9234.8x+13760.99850.075TCBPAy=15746x+58890.99910.029OPy=12489x+39870.99860.0314-NPy=16755x+60180.99760.053通过三倍信噪比(S/N)可以得到6种酚类化合物的检出限为0.029 mg/kg(TCBPA)~0.075 mg/kg(BPF)。2.4方法精密度和回收率用样品加标的方式制备得到0.5、5、20 mg/kg高中低三种浓度下的样品，并且每个浓度样品平行制备6份。采用1.4、1.5步骤进行分析检测得到测试结果，计算平行样的相对标准偏差(RSD)，即为方法的精密度，同时计算每一浓度下的平均回收率。表3为方法的回收率及精密度。从表3可以看出，0.5、5、20 mg/kg三个浓度下，平行样的RSD均小于6.5%，方法回收率均大于97%，确保检测结果的准确性。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.09.019.T003表3方法回收率及精密度（n=6）Tab.3The recovery rate and precision酚类化合物0.5 mg/kg5 mg/kg20 mg/kg回收率RSD回收率RSD回收率RSDBPA97.46.0101.44.7101.84.4BPB99.75.599.75.299.64.6BPF98.56.198.05.8100.23.8TCBPA100.55.8102.04.998.94.1OP98.76.3100.35.599.65.04-NP97.36.098.55.799.05.1%%2.5实际样品分析收集不同超市、不同品牌的食品包装袋和饮料瓶样品，共计20个，表4为检测结果。从表4可以看出，饮料瓶没有检出酚类化合物，而包装袋样品检出酚类化合物。其中BPB和BPF没有被检出，其余4种酚类化合物检出率从高到低为：BPA(5个)TCBPA(4个)OP(2个)、4-NP(2个)。虽然BPA的检出率最高，但GB 9658—2016中对双酚A的限量要求为0.6 mg/kg，所以检出的样品没有超标。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2021.09.019.T004表4市售样品检测结果Tab.4Test results of commercial samples样品类别样品编号BPABPBBPFTCBPAOP4-NP包装袋1n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.2n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.30.58n.d.n.d.0.12n.d.0.2740.49n.d.n.d.n.d.0.19n.d.5n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.6n.d.n.d.n.d.0.31n.d.n.d.7n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.8n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.9n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.100.40n.d.n.d.0.22n.d.0.2511n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.120.43n.d.n.d.0.37n.d.n.d.130.26n.d.n.d.n.d.0.11n.d.14n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.15n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.饮料瓶16n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.17n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.18n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.19n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.20n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.注：“n.d.”表示未检出。mg·kg-1mg·kg-13结论通过V(环己烷)∶V(甲醇)=3∶7的混合溶液，超声提取25 min，静置3 h的样品前处理，6种酚类化合物的检出限为0.029 mg/kg(TCBPA)~0.075 mg/kg(BPF)，精密度(RSD)均小于6.5%，回收率均大于97%。该方法具备高效、快捷、准确的优点。利用该方法检测市售食品包装材料，共检出BPA、TCBPA、OP、4-NP共4类酚类化合物。