芽孢杆菌（Bacillus sp.）是一类好氧或兼性厌氧、革兰氏染色阳性、产芽孢的杆状细菌。芽孢杆菌由于产生芽孢，能够抵抗环境中燥热和紫外线辐射等所造成的伤害，维持自身能力不受影响[1]。芽孢杆菌种类繁多、数量庞大，是自然界中广泛存在的非致病性细菌，对人畜无害，自然环境友好[2]。芽孢杆菌可以维持胃中的酸性环境。作为饲料添加剂，芽孢杆菌可以提高饲料利用率，降低饲养成本，预防和减少疾病发生[3]。在养猪生产中，为减少某些抗生素及生长促进剂的使用，添加芽孢杆菌可以在不影响生猪生产的前提下保证产品质量[2,4]。本课题组分离鉴定1株具有抑菌活性的短小芽孢杆菌B102。具有产酸、无残留、无污染、无耐药性和有抑菌作用等特性的芽孢杆菌菌株常用作动物的单一和复合益生素制剂[4]。本研究对短小芽孢杆菌B102株进行抑菌活性和安全性等试验，为短小芽孢杆菌B102株作为益生素候选菌株的潜在优势菌株的开发应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验用菌株：B102株，为本实验室（广东省预防兽医学重点试验室）在细菌分离培养过程中，分离出1株具有抑菌作用的短小芽孢杆菌，命名为短小芽孢杆菌B102。抑菌试验用指示细菌：金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、猪链球菌（CVCC 3307）和大肠杆菌（K12D31）为本室保存菌种；枯草芽孢杆菌、副猪嗜血杆菌和维氏气单胞菌均为本室分离菌种。培养基：血清琼脂培养基（0.5%血清，0.5% NAD）。牛血清、NAD、营养琼脂、营养肉汤、MRS液体培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。细菌生化反应试剂购自广东环凯微生物科技有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自青岛海博生物技术有限公司。细菌药敏试验纸片购自广东环凯微生物科技有限公司。试验动物：BALB/c小白鼠，购自广东省试验动物中心。1.2试验方法1.2.1细菌基因组DNA制备将血清琼脂平板活化的B102菌株接种于BSA培养基，37 ℃恒温培养18~24 h，取1.5 mL，5 000 g离心2 min，保留菌泥；菌泥沉淀物加入567 μL的TE缓冲液，吹打悬浮。加入30 μL 10% SDS和3 μL 20 g/L蛋白酶K，混匀，37 ℃温育1 h；加入100 μL 5mol/L NaCl，充分混匀，加入80 μL CTAB-NaCl溶液，混匀，65 ℃温育10 min；加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），混匀，10 000 g，离心5 min，将上清液移入一个新离心管中；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1），混匀，10 000 g，离心5 min，将上清液移入新离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，直到DNA沉淀，离心沉淀，70%乙醇洗涤2次；小心吸出乙醇，真空冷冻稍加干燥，重悬于100 μL TE缓冲液，-20 ℃保存备用。1.2.2细菌16S rRNA PCR扩增16S rRNA PCR扩增反应体系及条件见表1。设计合成细菌16S rRNA PCR引物，进行PCR扩增。产物在3%琼脂糖凝胶电泳，观察记录结果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.T001表116S rRNA PCR扩增反应体系及条件反应体系用量/μL反应条件2×premixTaq12.5变性94 ℃、5 min细菌基因组DNA2.094 ℃、45 sForward primer0.5复性52 ℃、45 sReverse primer0.5延伸72 ℃、1 minddH2O9.572 ℃、10 minTotal25.0注：变性、复性30次循环。1.2.3芽孢杆菌 B102的抑菌试验菌种活化及培养：从超低温冰箱中取出本试验室保存的芽孢杆菌B102菌种，在营养琼脂培养基上划线接种培养，37 ℃培养24 h，培养皿中挑取单一菌落并接种于MRS液体培养基中，37 ℃培养18 h。指示菌的培养：按2%的接种量接种在营养肉汤培养基中，37 ℃培养24 h。芽孢杆菌B102抑菌产物粗品的制备：将活化的芽孢杆菌B102在37 ℃摇床培养18 h的MRS液体培养物，高速冷冻离心（12 000 r/min、20 min、4 ℃），取上清液过0.22 μm滤膜，即为抑菌产物粗品，4℃保存备用。牛津杯法测定抑菌效果：利用0.85%的生理盐水将指示菌制成约1×107 CFU/mL（OD600 nm≈0.3）的菌悬液备用。待营养琼脂培养基凝固，吸取200 μL指示菌菌悬液于平板上，使用涂布棒涂布均匀，倒置培养1 h，放置牛津杯并在杯中加入200 μL抑菌产物粗品，并以培养基作为对照。在4 ℃冰箱中扩散12 h，将培养皿37 ℃恒温培养24 h，取出，测定抑菌圈直径，评价抑菌活性。1.2.4试验设计生长曲线、pH值、抑菌活性：将活化的短小芽孢杆菌B102接种到MRS培养基中，37 ℃培养，每隔2 h取样，以未接种的MRS液体培养基做空白对照，测定OD600 nm和pH值，24 h后，每隔4 h测定1次，至44 h。测定每个时间点的抑菌活性能力。抑菌谱：分别取短小芽孢杆菌B102的24 h和48 h抑菌产物粗品，采用牛津杯法对各指示菌做抑菌试验，以抑菌圈平均直径（mm）描述抑菌效果。细菌胞外多糖（EPS）提取方法：参照文献[11]的方法，活化菌种，挑取单个菌落，接种于50 mL MRS液体培养基，37 ℃摇床（120 r/min）培养48 h；5 000 r/min离心15 min；收集上清；保留10 mL上清，做平行试验。余下上清与4倍体积的冰冷无水乙醇充分混合，4 ℃放置10 min；7 000 r/min离心10 min；收集沉淀，使用丙酮和二乙基乙醚分别洗涤2次，50 ℃干燥，溶于5 mL无菌水中，即为初提细菌胞外多糖。保存于4 ℃备用。短小芽孢杆菌B102初提细菌胞外多糖与菌液的平行抑菌试验，参照1.2.3的方法进行。1.2.5短小芽孢杆菌B102药敏试验应用1.2.1制备的短小芽孢杆菌B102菌液，采用平皿药敏试纸片扩散法，进行药敏试验，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径（mm），记录结果。1.2.6短小芽孢杆菌B102小白鼠安全性试验饲喂菌液：活化菌种，挑取单个菌落，接种于MRS液体培养基，37 ℃、120 r/min摇床培养18~24 h，4 ℃保存备用。饲喂试验：选取15只BALB/c小白鼠，随机分为A、B、C共3组，每组5只。A组第1 d口服菌液0.1 mL/只；B组口服菌液0.2 mL/只；C组口服MRS液体培养基，作为对照组。第二天起，每天取菌液，按A组0.1 mL/只；B组0.2 mL/只，均匀拌于饲料中，自由采食。试验7 d，每天观察记录临床状况，称量体重，观察粪便情况，记录结果。2结果与分析2.1短小芽孢杆菌B102分离与鉴定2.1.1短小芽孢杆菌B102染色和菌落形态观察（见图1）由图1（b）可知，将B102接种于血清琼脂培养基，37 ℃恒温培养24 h，形成圆形、直径1.5~2.0 mm、微黄色、不透明菌落。由图1（a）可知，B102芽孢杆菌涂片，镜检，结果为革兰氏染色阳性，多数为单在、短直、中等大小的圆形或椭圆形中立芽孢。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.F001图1短小芽孢杆菌B102染色和菌落形态观察2.1.2短小芽孢杆菌B102生化反应鉴定结果（见表1）按细菌生化鉴定说明书，将B102菌株接种反应管，37 ℃培养24 h。由表1可知，根据生化鉴定结果并对照细菌生化鉴定编码册，确定该菌株为芽孢杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.T002表1B102芽孢杆菌生化鉴定结果项目结果项目结果葡萄糖＋6.5%高盐肉汤生长乳糖-丙二酸盐-半乳糖＋柠檬酸盐-麦芽糖＋硝酸盐还原-甘露醇＋淀粉水解＋蔗糖＋苯丙氨酸-纤维二糖＋尿素-D-核糖＋H2S-山梨醇＋运动性＋鼠李糖-注：“+”表示生化反应阳性，说明由于微生物各自的酶系统不同而发生显色反应；“-”表示生化反应阴性，说明阴性则不发生显色反应。2.1.3短小芽孢杆菌B102 16S rRNA PCR扩增与测序2.1.3.1B102芽孢杆菌基因组DNA 16S rRNA PCR扩增结果（见图2）按照方法中所述，提取B102芽孢杆菌基因组DNA，设计引物，对16S rRNA基因片段进行PCR扩增，采用3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照、观察。由图2可知，B102芽孢杆菌的16S rRNA的PCR扩增产物，在约1 670 bp处出现目的条带。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.F002图2B102芽孢杆菌基因组DNA 16S rRNA区域PCR扩增结果注：A为marker；B为“＋”对照；C为“-”对照；D为细菌DNA基因组。2.1.3.2短小芽孢杆菌B102 16S rRNA基因测序与分析（见图3、图4）对16S rDNA基因片段测序，并与基因BANK数据库进行序列同源性比较，建立遗传发育树。由图3、图4可知，B102芽孢杆菌菌株与已发布的3株短小芽孢杆菌16S rDNA基因序列同源性很高，均达到或超过99.9%，遗传距离最近，与蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、高山芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的遗传距离较远。因此，B102芽孢杆菌菌株确定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.F003图3B102芽孢杆菌与其他芽孢杆菌16S rRNA序列同源性比较分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.F004图4B102芽孢杆菌16S rRNA序列遗传发育树2.2短小芽孢杆菌B102抑菌性试验短小芽孢杆菌B102培养菌液和抑菌产物粗品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用见图5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.F005图5短小芽孢杆菌B102培养菌液和抑菌产物粗品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用由图5可知，B102芽孢杆菌培养液和滤液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用，抑菌圈直径为12~14 mm。2.3短小芽孢杆菌B102的生长特性和抑菌活性（见图6）由图6（a）可知，短小芽孢杆菌在培养约6 h进入对数生长期，快速繁殖，菌体浓度增加；培养10 h进入稳定期。由生长曲线分析，短小芽孢杆菌B102生长速度快，稳定期维持时间较长，至培养后约36 h。由图6（b）可知，培养菌液pH值自2 h开始下降，12 h降到最低，36 h维持在约4.5。结合图6（a）分析，短小芽孢杆菌在培养过程中持续产酸，对菌体繁殖影响不明显，说明短小芽孢杆菌B102具有产酸、耐酸性生长的特性。由图6（c）可知，培养菌液自2 h开始产生具有抑菌活性物质，8 h左右活性达到高峰，至36 h开始迅速下降，低于产生抑菌物质的起始水平。综合分析认为，短小芽孢杆菌B102抑菌产物产生较快，且与菌体的繁殖相关性不明显。培养菌液在培养期间pH值维持在约4.5~5.6。此期间B102抑菌产物活性维持在高水平，说明pH值环境对B102抑菌产物活性影响不明显，B102抑菌产物在pH值4.5~5.5维持在较高活性水平。培养36 h抑菌活性迅速下降，低于产生抑菌物质的起始水平。分析认为，抑菌活性与培养温度下的活性维持时间有关，有必要进一步研究。图6短小芽孢杆菌B102的生长特性和抑菌活性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.F6a1（a）短小芽孢杆菌B102抑菌粗产物活性试验的生长曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.F6a2（b）短小芽孢杆菌B102抑菌粗产物活性试验的pH变化曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.F6a3（c）短小芽孢杆菌B102抑菌粗产物活性试验的抑菌曲线2.4短小芽孢杆菌抑菌产物胞外多糖的抑菌谱（见表2）由表2可知，短小芽孢杆菌B102的24、48 h抑菌产物粗品和胞外多糖提取物对6种指示菌、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均产生较为明显的抑菌作用。24、48 h抑菌产物粗品均为“＋＋”；初提胞外多糖均为“＋”。比较分析发现，初提胞外多糖的抑菌活性水平总体低于抑菌产物粗品。用在提取胞外多糖的菌液上清也同样低于抑菌产物粗品，可能与菌液上清保存在4 ℃时间较长有关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.T003表2短小芽孢杆菌抑菌产物胞外多糖的抑菌谱项目金黄色葡萄球菌猪链球菌枯草杆菌大肠杆菌副猪嗜血杆菌维氏气单胞菌24 h抑菌产物13.5121416141348 h抑菌产物141313151414初提胞外多糖889878菌液上清81213121010注：抑菌圈直径（mm）≥12判定为“＋＋”，6~12判定为“＋”，无抑菌圈为“-”。mm2.5短小芽孢杆菌B102药敏试验结果（见表3）由表3可知，与枯草芽孢杆菌相比，短小芽孢杆菌B102对所选择的7种常用的代表性药物中的阿米卡星、复方新诺明和多西环素产生耐药，对头孢菌素和青霉素中度敏感，对阿莫西林极敏，对恩诺沙星高度敏感。短小芽孢杆菌B102作为益生素的候选菌株仍需选择多种药物进行药敏试验，并在安全性试验的基础上加以确认。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.16.020.T004表3短小芽孢杆菌B102药敏试验结果试验菌株阿莫西林阿米卡星头孢菌素恩诺沙星复方新诺明青霉素多西环素芽孢杆菌B10232012180140枯草芽孢杆菌1625332801517注：20以上为极敏、15~20高敏、10~14中敏、10以下低敏、0不敏。mm2.6短小芽孢杆菌B102对小白鼠的安全性试验试验小白鼠试验期间食欲明显提高，粪便正常。无死亡、发病。结果表明，口服短小芽孢杆菌B102对小白鼠无致病性，安全。鉴于喂饲试验时间较短，具体增重及相关指标与对照组差异不明显。3讨论3.1短小芽孢杆菌B102的分离鉴定与抑菌性从菌株的分离来源看，在金黄色葡萄球菌培养时和应用牛津杯方法抑菌试验时，发现杯边缘有污染的类似芽孢杆菌的菌苔，立刻进行简单的分离培养。在此基础上，分离获得短小芽孢杆菌B102株。这一菌苔发现的平皿是同试验用鸡胚在同一鼓风温箱中培养，推测短小芽孢杆菌B102可能源自胚蛋表面污染饲料中的鱼粉。有研究表明，细菌产生的胞外多糖具有促进肠道健康、改变微生物组合物、增强免疫的活性、改善血流的功能[5-7]。EPS的作用取决于微生物区系所在的生态环境。EPS维系着微生物群体耐受极端温度、高盐和营养缺乏的生存条件。本试验在分离鉴定的同时，进行短小芽孢杆菌B102株产EPS乙醇沉淀试验，结果发现，短小芽孢杆菌B102株产胞外多糖的量较高。短小芽孢杆菌B102株的生物学特性，尤其是细菌产胞外多糖的生物学作用等有待进一步研究。在抑菌的生物学特性研究发现，短小芽孢杆菌中不同的菌株的抑菌特性和抑菌谱是不完全相同的。综合国内外的研究结果，产生抑菌作用的物质的性质主要分为两类：一类是对蛋白酶类敏感的各种细菌素[8]；另一类是对蛋白酶类不敏感的细菌EPS[9-10]。短小芽孢杆菌产生的抑菌物质大多数倾向于前者。也有一些研究认为，短小芽孢杆菌产生的抑菌活性物质是胞外多糖。本试验初步表明，短小芽孢杆菌B102株培养液和滤液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有较明显的抑制作用，发挥抑菌作用的是细菌胞外多糖还是细菌素等多肽类物质有待于深入研究。3.2短小芽孢杆菌B102的生长特性与抑菌性本研究表明，短小芽孢杆菌在培养后6 h左右进入对数生长期，短小芽孢杆菌B102生长速度快，稳定期维持时间较长，可以至培养约36 h；在培养过程中具有持续性产酸、耐酸生长的特性；培养菌液2 h开始产生具有抑菌活性物质，活性约8 h达到高峰，至36 h开始迅速下降，低于产生抑菌物质的起始水平，pH值对B102抑菌产物活性影响不明显。培养36 h抑菌活性迅速下降，低于产生抑菌物质的起始水平，认为抑菌活性与培养温度下的活性维持时间有关，有必要进一步试验研究。短小芽孢杆菌B102在培养整个过程都可以产生抑菌性物质。结果表明，短小芽孢杆菌B102的24 h、48 h抑菌产物粗品和胞外多糖提取物对6种指示菌，革兰氏阴性细菌（大肠杆菌、副猪嗜血杆菌和维氏气单胞菌）和革兰氏阳性细菌（金黄色葡萄球菌、猪链球菌和枯草杆菌）均产生较为明显的抑菌作用。结合B102的抑菌活性曲线分析，培养菌液自2 h产生开始具有抑菌活性物质，8 h左右活性达到高峰，至36 h开始迅速下降，低于产生抑菌物质的起始水平。分析认为，抑菌活性与培养温度下的活性维持时间有关。本试验抑菌粗品、胞外多糖提取物在提取过程中活性降低，可能是抑菌活性作用或细菌素的作用，有必要进一步试验研究。国内外的相关短小芽孢杆菌研究过程中也有相同或相似的结果[11-12]。一些研究认为是细菌素的作用[13-15]，也有研究认为抑菌物质对温度敏感、对蛋白酶敏感，可能是胞外多糖的作用[16-18]。本研究结果倾向于蛋白质或小肽的细菌素和细菌胞外多糖的共同作用。短小芽孢杆菌B102在培养整个过程都可以产生抑菌性物质，基本具备益生素菌株的要求，具有重要的潜在研究价值。3.3短小芽孢杆菌作为益生菌株的前景益生菌通过与有害菌竞争氧、营养和定植位点，抑制有害菌增殖，改变动物肠内菌群平衡，使肠内环境得到净化。益生菌通过抗氧化作用、抗变异作用、生理活性作用、免疫刺激等方式对宿主发挥机体调节、机体防御、预防疾病、治疗疾病等功效[19]。短小芽孢杆菌作为重要的益生菌种越来越受到科研人员的重视。本试验中，与枯草芽孢杆菌相比，短小芽孢杆菌B102对所选择的7种常用的代表性药物中的3种产生耐药，对阿莫西林和恩诺沙星敏感；口服短小芽孢杆菌B102对小白鼠无致病性。因此，短小芽孢杆菌B102可作为益生菌株应用在饲料养殖行业。但是，短小芽孢杆菌B102作为益生素的候选菌株仍需选择多种药物进行药敏试验加以研究。4结论本试验分离鉴定的短小芽孢杆菌B102具有优良的抗菌特性和生长特性，对常规药物无耐药性，且安全可靠。