粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是一种分子量为18~22 kDa的糖蛋白，通过与其受体GM-CSFR相结合发挥功能。GM-CSF是主要的造血生长因子之一，在造血调控和免疫调节中发挥重要作用。GM-CSF通过调控粒细胞、单核巨噬细胞以及激活树突状细胞，在外周组织中发挥功能[1]，也能够刺激骨髓细胞生成粒细胞以及巨噬细胞、T细胞等免疫细胞的增殖[2]。1994年，Brannstrom等[3]发现，大鼠卵巢能分泌具有生物活性的GM-CSF，分泌水平在排卵时达到峰值。1996年，Jasper等[4]发现，人类卵泡液中的GM-CSF随着生殖周期的变化而改变，体外培养的颗粒性黄体细胞和卵泡膜性黄体细胞均分泌GM-CSF，表达为其受体GM-CSFRα和β。在GM-CSF敲除小鼠的卵巢功能研究中发现，与正常小鼠相比，双敲（GM-/-）妊娠小鼠卵巢中细胞数明显减少，孕酮表达水平降低，表示GM-CSF影响早期妊娠双敲小鼠（GM-/-）黄体的分泌功能，但不影响卵巢正常功能的发挥[5]。有研究表明，子宫上皮细胞能够分泌GM-CSF，原位杂交结果证明了子宫内膜上皮和腺上皮是GM-CSF表达的主要部位。卵巢分泌的生殖激素对GM-CSF有调节作用，这种雌激素诱导的分泌增加可以通过联合使用孕酮来抑制[6]。在牛的整个发情周期中，输卵管和子宫内膜都可见GM-CSF的表达。可见，GM-CSF是调节胚胎发育的一个重要细胞因子[7]。与正常体型牛相比，GM-CSF在肥胖牛的输卵管壶腹部的表达较低，可能与其生产的优质胚胎数量较少有关[8]。还有研究发现，在发情周期和妊娠早期的小鼠子宫内膜上皮分泌的GM-CSF，是类固醇激素调节子宫内中性粒细胞、巨噬细胞的激活和募集的重要调控因子[9]。GM-CSF能够促进小鼠附植前胚胎的发育和存活，可能与其对细胞应激反应和凋亡通路的抑制作用有关[10]。猪胚胎发育过程中，培养基添加2 μg/L或10 μg/L的GM-CSF，体外受精与核移植胚胎的囊胚率和囊胚细胞数量均明显增加，在囊胚期移植后经过GM-CSF处理的胚胎可成功进行核移植[11]。GM-CSF受体α和β在牛的卵丘细胞和卵母细胞上均有表达，可提高卵丘细胞扩展率[12]。试验旨在研究猪卵母细胞体外培养过程中，GM-CSF对卵母细胞的极体排出率、卵丘细胞的扩展率的影响。1材料与方法1.1试验材料重组GM-CSF（北京中科拜克生物技术有限公司）、M199培养基（GIBCO）、CCK-8检测试剂盒（日本同仁）、M199基础培养液（Biosharp）。1.2药品配制捡卵液（M199基础培养液28 mL+ 200 μL肝素钠储液），洗卵液（M199基础培养液2 mL+胎牛血清100 μL，试验前2 h配好放入恒温箱平衡）成熟培养液配制：M199基础培养液730 μL+双抗（100 IU/mL青霉素+100 μg/mL硫酸链霉素）+10 μL葡萄糖储液(0.55 g/mL)+10 μL NaHCO3储液（0.03 g/mL）（SIGMA V900182）+10 μL丙酮酸钠储液（0.03 g/mL）(EKEAR SO131）+10 μL PVA储液（0.01 g/mL）（EKEAR P0207）+l-半胱氨酸储液（0.07 g/mL）（SIGMA c7352-100G）+4%胎牛血清（Biosharp）试验前2 h配好放入恒温箱平衡。试验开始前添加10 IU/mL PMSG（北京索莱宝科技有限公司）+10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素HCG（北京索莱宝科技有限公司）。1.3卵母细胞体外培养1.3.1卵母细胞的收集猪卵巢无菌采集于兰州市榆中县生猪屠宰场，选择9头6~7月龄健康长白猪卵巢，将采集到的卵巢保存于PBS缓冲液中，2 h内带回实验室。37 ℃恒温捡卵，选择胞质均匀、颜色较深、颗粒细胞包裹紧密、达3层以上的COC，在洗卵液、成熟液中各冲洗2次备用[13]。1.3.2成熟液的分组将获取的猪卵泡卵母细胞置于35 mm胚胎培养皿中，做成3个200 μL的微滴，随后覆盖石蜡油。每个液滴中放入30~40个卵母细胞，每皿1组，随机分为3组，每组3个试验重复。试验组1为成熟培养液；试验组2为成熟培养液中添加10 μg/L的GM-CSF；试验组3为成熟培养液中添加100 μg/L的GM-CSF。1.3.3卵母细胞成熟培养洗涤后的卵母细胞放入38 ℃、5% CO2饱和温度条件培养48 h，进行机体排出率和卵丘扩展情况的统计，并收集卵丘细胞进行检测。1.4试验方法按照CCK8检测试剂盒说明，将在成熟培养液中培养12、24及48 h的COC上的卵丘细胞吹下，接种于96孔板中。每孔加入100 μL的卵丘细胞至含4%胎牛血清的培养液中，在二氧化碳培养箱中37 ℃培养24 h后加入10 μL CCK8检测试剂，培养箱中孵育2 h至培养液显色为粉红色，并设空白对照组，在酶标仪中检测OD值。OD值按照试剂盒提供的细胞活力计算方法进行计算并统计。细胞活力=[A(加药)-A（空白）]/[A(0加药)-A(空白)]×100%（1）1.5数据统计与分析采用Graph Pad Prism 8软件进行差异显著性分析和制图，基因表达与蛋白表达的组间差异性分析采用t检验，各级卵丘细胞扩展和卵母细胞极体排出率统计采用单因素方差分析，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1卵丘细胞扩展程度分级及成熟卵母细胞判定（见图1）倒置显微镜下将卵母细胞的按卵丘扩展程度进行分类。由图1（a）可知，0级为卵母细胞的卵丘细胞脱落退化；由图1（b）可知，1级为卵母细胞的卵丘细胞只有一层或最外围扩散，卵丘细胞少且不均匀；由图1（c）可知，2级为卵母细胞的卵丘细胞的外层出现扩散，层数增多，卵丘细胞包裹紧密颜色深；由图1（d）可知，3级为卵母细胞的卵丘细胞除放射冠外开始全部扩散，卵丘细胞颜色较浅，胞质均匀；由图1（e）可知，4级为卵母细胞的卵丘细胞全部扩散；由图1（f）可知，吹打下卵丘细胞，观察成熟卵母细胞，卵黄间隙上出现极体即可判定为成熟。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.10.001.F001图1卵丘细胞扩展程度分级及成熟卵母细胞形态Fig.1Scale of cumulus cell expansion and morphology of mature oocytes2.2GM-CSF对卵丘细胞扩展和卵母细胞成熟的影响（见表1）由表1可知，卵丘扩展程度为3~4级的卵丘细胞百分数在各组别间差异性显著（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.10.001.T001表1卵丘细胞扩展和卵母细胞极体排出率Tab.1Cumulus cell expansion and oocyte polar body excretion rate组别0级1~2级3~4级成熟卵母细胞总数013.00±4.0060.33±4.3326.67±4.33a56.67±1.20100.00±4.0010 μg/L13.00±9.0055.67±2.3331.33±2.33b59.17±2.54100.00±1.00100 μg/L12.33±2.3357.00±4.0032.67±2.33c55.16±1.80102.00±1.00注 ：同列数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），不同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%2.3GM-CSF对卵丘细胞活性的影响（见图2）将含有不同浓度GM-CSF的COC培养12、24、48 h后，放入0.2%透明质酸的M199培养液中，于培养箱中孵育5 min，使用10 μL移液枪轻轻吹打COC。将脱落下来的卵丘细胞1 500 r/min离心收集，加入4%胎牛血清后均匀注入96孔板中培养24 h，再加入CCK-8进行活性检测，每组试验均设3个重复。由图2可知，不同培养时间的GM-CSF组细胞活性均高于对照组，且48 h时，10、100 μg/L的GM-CSF组细胞活性极显著高于对照组（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.10.001.F002图2GM-CSF对卵丘细胞活性的影响（n=3）Fig.2Effect of GM-CSF on cumulus cell activity (n=3)注：不同大写字母表示差异极显著（P0.01）。3讨论通过组织学定位发现，GM-CSF受体在牛卵巢中可与颗粒细胞孕酮分泌的相关蛋白3β-HSD及卵泡刺激素FSHR在牛卵巢中共表达，暗示其可能对颗粒细胞的激素分泌功能有影响。体外培养卵巢颗粒细胞中，添加GM-CSF可以增加颗粒细胞2-脱氧葡萄糖（DOG）或3-O-甲基葡萄糖（OMG）的吸收，暗示其可调节牛卵巢颗粒细胞糖代谢的活性[11]。在关于牛卵丘细胞的研究中发现，体外培养的卵母细胞在SOF培养基中添加0、1、10和100 μL的人重组GM-CSF，22 h后分析扩展指数（CEI）和极体排出率，发现GM-CSF受体在卵丘细胞和卵母细胞中均出现，10 μg/L和100 μg/L组扩展指数为0.8和1.22，高于0.22的对照组。但极体排出率没有明显差异。100 μg/L组的卵丘细胞生存率比对照组高出20%，且差异极显著。且10 μg/L和100 μg/L增加卵丘细胞数量分别为20%和50%。而GM-CSF特异性抑制剂IP3细胞因子对以上差异均有抑制作用[13]。GM-CSF对体外培养卵丘细胞和卵母细胞的代谢有显著影响[14]。文献报道，排卵前卵泡及多囊卵泡综合征患者卵泡液中均含有GM-CSF[4,15-16]。试验在未添加猪卵泡液（PFF）的情况下，10 μg/L组与100 μg/L组的GM-CSF对卵丘细胞扩展均具有明显的促进作用，且主要提高扩展程度较高的3~4级卵丘细胞，对扩展程度较低的0~2级卵丘细胞的扩展无明显作用，说明GM-CSF对卵丘细胞的扩展与COC的自身状态有关，即GM-CSF能促进质量较好的COC的卵丘细胞扩展，但不能逆转质量较差的卵丘扩展。GM-CSF虽然能提高3~4级卵丘细胞的扩展数，但对极体排出及卵母细胞成熟率无显著影响。孙兴参等[17]研究猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟的关系，发现卵丘细胞扩展充分与否与卵母细胞核成熟无显著相关，在去除卵母细胞的COC中，卵丘细胞的扩展不受卵母细胞的影响，说明卵丘细胞扩展与否并不对卵母细胞成熟起决定作用，GM-CSF对卵母细胞成熟没有显著促进作用，与Oscar等[12]在牛卵丘细胞扩展中得出的结论一致。本试验中，分别对COC中GM-CSF孵育12、24、48 h的卵丘细胞的细胞活性进行检测，结果表明，3个时间段的细胞活性在10 μg/L组与100 μg/L组均有所提高，作用48 h后的细胞活性组间差异显著（P0.05）。4结论GM-CSF能够显著提高3~4级猪卵丘细胞扩展率及卵丘细胞的活性。