人们对肉食产品需求量增加，推动着养殖规模不断扩增，因此，饲料的需求量也在增加[1]。将年产量巨大的农作物副产品如秸秆、菜籽杆等开发利用为饲料，能够缓解饲料的需求和环境压力，降低饲料生产成本[2-5]。酸性纤维素酶在饲料中有着重要作用，是目前饲料添加剂研究的重点[6]。有研究发现，在牲畜饲料中添加酸性纤维素酶可以促进食欲，增加和补充动物体内消化酶的含量，预防和治疗一些家畜常见肠道疾病；在青贮饲料添加酸性纤维素酶能够降低青贮饲料的硬度，提升青贮饲料的口感；添加酸性纤维素酶的饲料不仅利于动物对营养的吸收，还能够提高动物的肉品质并缩短绵羊的育肥时间[7-13]。关于动物胃肠中纤维素降解菌的研究较多，李国伟等[14]从双峰驼粪便中得到纤维素酶最适pH值为4.5的香坊肠杆菌；韦海婷等[15]、张智等[16]分别从梅花鹿瘤胃液及大熊猫粪便中得到纤维素酶最适pH值为6的蜡杨芽孢杆菌和Paenibacillus cookie LZ033；马宁等[17]从牛瘤胃中到1株纤维素酶最适pH值为5的假黄单胞菌。竹鼠属于草食性动物，日常主要以纤维素和半纤维素含量丰富的竹子、草根、草秆、甘蔗、玉米等为主要食物，消化粗纤维的能力突出。推测竹鼠肠道及粪便中可能存在具有高降解纤维素能力的特色菌株。因此，本试验旨在获得良好的酸性纤维素酶，为解决饲料中酶添加剂的应用问题提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1样品来源竹鼠粪便采自四川省宜宾市南溪当地农家饲养的银星。1.1.2培养基富集培养基：羧甲基纤维素钠2 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.1 g、氯化钠0.5 g、硫酸锰0.5 g、七水硫酸亚铁0.1 g、酵母浸粉1 g、蛋白胨1 g、蒸馏水1 000 mL，自然pH值，121 °C灭菌20 min。初筛培养基：羧甲基纤维素钠20 g、磷酸氢二钠2.5 g、磷酸二氢钾1.5 g、蛋白胨2.5 g、酵母浸粉0.5 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 000 mL，自然pH值，121 °C灭菌20 min。发酵培养基：羧甲基纤维素钠10 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、硫酸铵2 g、氯化钠2.5 g、酵母浸粉2.5 g、蛋白胨5 g、蒸馏水1 000 mL，自然pH值，121 °C灭菌20 min。1.1.3试验试剂刚果红、氯化钠、柠檬酸、氢氧化钠、羧甲基纤维素钠、七水硫酸亚铁、3,5-二硝基水杨酸、葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、七水硫酸镁、硫酸锰、硫酸铵、琼脂粉均为分析纯，购自成都市科龙化学品有限公司。1.1.4仪器设备UV—1800型紫外分光光度计（上海翱艺仪器有限公司）、立式自动压力蒸汽灭菌器（厦门致微仪器有限公司）、生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司）、超净工作台（常州普天仪器制造有限公司）、高速冷冻离心机（艾本德生命科学公司）。1.2试验方法1.2.1产纤维素酶菌株筛选取1 g竹鼠肠道内容物于50 mL无菌生理盐水中，37 ℃、180 r/min摇床振荡60 min；取1 mL加入富集培养基，置于恒温培养箱37 ℃、180 r/min培养3 d。取1 mL富集培养液使用无菌水进行倍比稀释，涂布到初筛培养基平板，37 ℃培养24 h，刚果红溶液染色5 min，使用1 mol/L NaCl溶液彻底洗去染液，选择透明圈直径和菌落直径比值较大的菌落在初筛培养基平板划线，纯化3次，甘油-80 ℃、斜面4 ℃保藏。将初筛纯化后的菌株接种在LB培养基中，37 ℃培养12 h，接种（2%）在发酵培养基，37 ℃、180 r/min培养3 d，取10 mL发酵液于离心管中，4 ℃、7 000 r/min离心15 min，制备粗酶液。1.2.2酶活力测定方法葡萄糖标准曲线的绘制：取7支试管，加入1 g/L的葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，补加蒸馏水至2 mL，加入1.5 mL DNS试剂，混匀煮沸5 min，转移至冷水槽中冷却，定容至10 mL，在540 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。滤纸酶活力测定：将已裁剪为1×6 cm的卷状的滤纸条加入试管，加入1.5 mL pH值为4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液浸没滤纸条，加入0.5 mL粗酶液，50 ℃下静置1 h；加入1.5 mL DNS试剂，混匀煮沸5 min，转移至冷水槽中冷却，定容至10 mL，在540 nm处测定吸光度。空白对照中加入等体积灭活粗酶液。内切葡聚糖酶活力（纤维素酶活力）的测定：试管中加入0.5 mL粗酶液与1.5mL 1% CMC-Na底物（pH值为4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液所配置），50 ℃反应30 min，加入1.5 mL DNS试剂，混匀煮沸5 min，转移至冷水槽中冷却，定容至10 mL，在540 nm处测定吸光度。空白对照中加入等量灭活粗酶液。β-葡萄糖苷酶活力测定：试管中加入1.5 mL 0.5%水杨苷溶液（0.5 g水杨苷溶解在100 mL、pH值为4.8的缓冲液）和0.5 mL粗酶液，混匀，50 ℃静置30 min，加入1.5 mL DNS试剂，混匀煮沸5 min，转移至冷水槽中冷却，定容至10 mL，在540 nm处测定吸光度。空白中加入等体积的灭活粗酶液。酶活力定义：在上述试验中，每毫升粗酶液每分钟催化底物产生1微摩尔还原糖的酶量定义为1个酶活力单位。酶活力(U/mL)=N×1 000T×0.5×180 (1)式中：N为根据葡萄糖标准曲线计算得葡萄糖生成的质量（mg）；T为反应时间（min）；180为葡萄糖的分子量。1.2.3菌株的鉴定分子生物学鉴定：利用细菌基因组快速抽提试剂盒提取基因组。以细菌基因组DNA为模版，以16S rDNA通用引物进行PCR扩增，引物序列为：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，将产物送至成都擎科生物公司进行测序，测序结果在NCBI上进行Blast比对，使用MEGA 7中的邻近相连算法（Neighbor-Joining）构建系统进化树，确定所鉴定菌株的属或种。1.2.4酶学性质初步研究最适温度：在20、30、40、50、60、70、80 ℃条件下测定粗酶液纤维素酶活力，探究酶的最适反应温度。温度稳定性：粗酶液在20、30、40、50、60、70、80 ℃保温60 min，40 ℃下测定纤维素酶酶活力，探究酶的温度稳定性。最适pH值：粗酶液分别与pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11的底物反应，40 ℃下测定纤维素酶活力，探究酶反应的最适pH值。柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH值为3.0~6.0；磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液pH值为7.0~8.0；甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液pH值为9.0~11.0。pH值的稳定性：粗酶液与pH值为3、4、5、6、7、8的缓冲液1∶2混匀，保温60 min，40 ℃下测定纤维素酶活力，探究酶的pH值稳定性。金属离子对酶活力的影响：分别在粗酶液加入5 mmol/L的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+溶液，对照组加水，常温静置60 min，40 ℃下测定纤维素酶活力。2结果与分析2.1碳源的初筛结果菌株的刚果红透明圈结果见表1。通过CMC—Na作唯一碳源的初筛平板，从竹鼠肠道筛选分离出4株具有刚果红透明圈的菌株，依次编号为G-1、G-2、G-3和G-4。由表1可知，4株菌的透明圈直径在9~10 mm；但菌株G-1的菌落直径是4株菌中最短的，菌株G-1的D/d值最大。菌株G-4的D/d值最小，为1.7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.016.T001表1菌株的刚果红透明圈结果菌株名称透明圈直径（D）/mm菌落直径（d）/mmD/d值G-19.0±0.63.0±0.63.0G-210.0±1.05.0±0.62.0G-310.0±1.04.0±0.62.5G-410.0±1.06.0±0.61.72.2菌株的复筛结果将G-1、G-2、G-3及G-4菌株接种到发酵液中，放入摇床中，37 ℃、180 r/min培养3 d，取发酵液4 ℃、7 000 r/min离心15 min，取上清液；测定菌株3种酶活力，通过葡萄糖含量与吸光度的关系式和酶活力计算公式计算酶活力。葡萄糖标准曲线见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.016.F001图1葡萄糖标准曲线4株菌株的3种酶活力见图2。由图2可知，G-1菌株的3种酶活力最高，滤纸酶活力为0.093 U/mL、内切葡聚糖酶活力为0.164 U/mL、β-葡萄糖苷酶活力为0.121 U/mL；其次是菌株G-2，3种酶的活力分别为0.062、0.109、0.089 U/mL；然后是G-3，3种酶的活力分别为0.060、0.100、0.075 U/mL；菌株G-4的3种酶活力最低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.016.F002图2菌株的3种酶活力2.3菌株的鉴定菌株G-1的菌落形态和革兰氏染色见图3。由图3可知，菌株G-1菌落呈圆形，表面光滑且不透明，边缘整齐；革兰氏染色为阳性菌，显微镜下菌体形态为杆状。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.016.F003图3菌株G-1的菌落形态和革兰氏染色将菌株G-1的测序结果在NCBI进行Blast比对，选择相似性在95%以上的菌株序列下载，通过MEGA 7软件中的Neighbor-Joining构建系统进化树。菌株G-1的系统进化树见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.016.F004图4菌株G-1的系统进化树由图4可知，菌株G-1与干燥杆菌属（Siccibacter colletis）亲缘关系最为接近，可判断菌株G-1为干燥杆菌属。2.4酶学性质初步研究2.4.1酶最适反应温度将菌株G-1粗酶液在不同温度下催化反应30 min。纤维素酶最适反应温度见图5。由图5可知，在20~40 ℃时，纤维素酶活力随温度升高而升高，40 ℃时，酶活达到峰值，温度超过40 ℃后，G-1的酶活力逐渐衰减。因此，纤维素酶的最适温度为40 ℃，属于低温酶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.016.F005图5纤维素酶最适反应温度2.4.2酶温度稳定性将菌株G-1的粗酶液分别在20、30、40、50、60、70、80 ℃保温60 min，检测酶活力并以其中的最大值为基准来计算相对酶活。纤维素酶温度稳定性见图6。由图6可知，在20 ℃保温处理60 min，纤维素酶能保持70%以上的活力；温度在30~50 ℃范围内，相对酶活在90%以上，温度超过50 ℃，纤维素酶活力迅速降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.016.F006图6纤维素酶温度稳定性2.4.3酶的最适pH值将菌株G-1的粗酶液在不同pH值下静置催化30 min，检测其酶活力得最适pH值，以最大酶活力为基准来计算相对酶活，纤维素酶最适pH值见图7。由图7可知，纤维素酶的最适pH值为4，当pH值在3.0和8.0~11.0范围内，纤维素酶的相对酶活在80%以下；当pH值在4.0~7.0范围内，纤维素酶的相对酶活保持在90%以上。因此，可以确定此纤维素酶为酸性纤维素酶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.016.F007图7纤维素酶最适pH值2.4.4酶pH稳定性纤维素酶的pH值稳定性见图8。由图8可知，菌株G-1粗酶液在不同pH值缓冲液中处理60 min。pH值在7~8范围内时，菌株G-1的相对酶活不足60%；pH值在4.0~6.0范围内，菌株G-1仍能有85%以上的相对酶活。因此，此纤维素酶在酸性环境下具有良好的耐受性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.016.F008图8纤维素酶pH值稳定性2.4.5金属离子对酶活力的影响在菌株G-1的粗酶液中添加不同金属离子处理60 min，检测其酶活力，以不添加金属离子的纤维素酶活力为100%。金属离子对纤维素酶活力的影响见图9。由图9可知，Mn2+、Ca2+及Cu2+对纤维素酶有促进作用，其中Mn2+对纤维素酶的促进作用最大，相对酶活为137%；Mg2+、K+及Fe3+对纤维素酶有抑制作用，其中Fe3+对纤维素酶的抑制作用最大，相对酶活为67%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.016.F009图9金属离子对纤维素酶活力的影响3讨论目前，关于产纤维素酶菌株的筛选已有许多报道。宁俊平[18]从竹鼠肠道得到纤维素降解菌株沙雷氏菌和肺炎克伯雷氏的内切纤维素酶活性可达0.502 9、0.487 4 U/mL。曹晓燕等[19]筛选得到的2株与酪酸梭状芽孢杆菌（Clostridium butyricum）有高度同源性的菌株，其纤维素酶活分别为6.599和5.268 U/mL。曾文婷等[20]筛选得到枯草芽孢杆菌，其内切纤维素酶活性可达30.59 U/mL。赵姗等[21]从大熊猫肠道得到的蜡样芽孢杆菌的内切纤维素酶活性为0.139 IU/mL。与之前的研究相比，本试验得到的纤维素酶活性较低，可能因为其他报道的纤维素酶普遍适用于中性以及弱酸的环境，对于酸性环境适应能力较差。本试验所得到纤维素酶在酸性环境下仍有良好的耐受能力，具备进一步开发利用的潜力。4结论本研究酶学性质结果表明，菌株G-1所产纤维素酶最适温度为40 ℃，最适pH值为4.0；在30~50 ℃时，保持90%以上酶活性；pH值在4.0~6.0时，菌株G-1有85%以上的相对酶活，菌株G-1对酸性环境有较强的抗性；Mn2+对纤维素酶有明显的促进作用，Fe3+有明显的抑制效果。