淀粉是人类的主要食物来源，也是工业生产的重要原料[1]。工业生产中利用淀粉酶的糖化作用水解淀粉产生单糖糊精、麦芽糖和葡萄糖[2]。淀粉酶种类繁多，在烘焙、纺织、酿酒、医药、饲料、洗涤剂和造纸等领域均有重要的应用价值[3-6]。研究表明，酿酒时加入淀粉酶可以提高酒精质量，降低生产成本；在面粉中添加适量淀粉酶可以改善面团质量，增强面条口感；在饲料中添加淀粉酶可以提高饲料转化率，改善畜禽生产性能[7-10]。淀粉酶是水解淀粉及糖原的酶类的总称，广泛分布在动植物和微生物细胞中[11]。微生物源淀粉酶具有生产效率高、成本低、时间短、热稳定性好、一致性好、生产工艺易于修改和优化等优点[12-13]。但随着淀粉酶品种和产能不断增加，淀粉酶的提取工艺仍需完善[14]。构建产酶基因工程菌株存在成本高、难度大等问题，淀粉酶的提取仍以分离野生菌株后驯化为主，不断从自然界中筛选性能优良的菌株[15-16]。本研究前期从青藏高原土壤中分离出1株高产淀粉酶菌株Bacillus subtilis XC2，初步探究该淀粉酶酶学性质并优化菌株发酵产酶条件，以期开发新的淀粉酶资源，筛选出性能优良的菌种及酶资源，为淀粉酶作为饲料添加剂在畜禽生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种来源青藏高原（青海省海北州门源县，37 °N101 °E）海拔3 175 m处采集土壤，经实验室分离、筛选出菌株Bacillus subtilis XC2，保存，备用。1.1.2培养基活化培养基：可溶性淀粉20 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 0.1 g/L、Na2HPO4 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH值7.0~7.5，121 ℃灭菌20 min。发酵培养基：可溶性淀粉20 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH值7.0~7.5，121 ℃灭菌20 min。1.1.3试验试剂可溶性淀粉（北京双旋微生物培养基制品厂）；牛肉膏、蛋白胨（北京奥博星生物技术有限公司）；蔗糖、H2S04、碘、碘化钾、氯化钾（西陇化工股份有限公司）；结晶紫（天津市科密欧化学试剂有限公司）；刚果红（天津市风船化学试剂科技有限公司）。1.2仪器设备CX31生物显微镜（OLYMPUS有限公司）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；LS-30压力蒸汽灭菌器、SPX-150B-Z型生化培养箱、THZ-92C气浴恒温振荡器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；超净工作台（苏净集团安泰公司）；恒温水浴锅（上海科銮仪器有限公司）；分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；血球计数板（上海市求精生化试剂仪器有限公司）。1.3试验方法1.3.1粗酶液制备菌株XC2接种于发酵培养基，28 ℃、200 r/min培养24 h，发酵液12 000 r/min离心10 min，制得粗酶液。1.3.2淀粉酶活力的测定0.2 mL粗酶液与2 mL底物（0.5%淀粉溶液）混匀，40 ℃反应l0 min，加入2 mL的0.1 mol/L H2S04终止反应。取0.1 mL反应液，加入1 mL的0.4 mmol/L碘液显色，于波长620 nm测定吸光度。先加入硫酸终止反应组为对照组。酶活定义：在pH值7.0、40 ℃条件下，每分钟水解1 mg淀粉的酶量为一个酶活力单位U/mL。1.4酶学特性研究1.4.1温度对淀粉酶活力的影响测定粗酶液在20、30、40、50、60、70 ℃的淀粉酶活力以确定酶反应的最适温度。粗酶液在30、40、50、60、70 ℃保温1 h，40 ℃时测定剩余淀粉酶活力，确定酶的温度稳定性。1.4.2pH值对淀粉酶活力的影响测定粗酶液在pH值为4、5、6、7、8、9条件下的淀粉酶活力以确定酶反应的最适pH值。粗酶液与pH值为4、5、6、7、8、9的缓冲液1∶1混匀，保温1 h，40 ℃测定剩余淀粉酶活力，确定酶的pH值稳定性。1.4.3金属离子对淀粉酶活力的影响在酶的反应体系中分别加入10 mmol/L的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+，以不添加金属离子为对照组，40 ℃测定淀粉酶活力。1.5菌株XC2发酵产酶条件优化1.5.1营养条件对菌株XC2产淀粉酶的影响以初始发酵培养基为基础，28 ℃、200 r/min振荡培养24 h，测定淀粉酶活力。考察不同碳源（葡萄糖、淀粉、乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖）及碳源添加量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%）、不同氮源（硫酸铵、硝酸钠、干酪素、蛋白胨、牛肉膏）及氮源添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%）、不同金属离子（Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+）及金属离子添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）对菌株XC2产淀粉酶的影响。1.5.2培养条件对菌株XC2产淀粉酶的影响以初始发酵培养基为基础，振荡培养24 h，测定淀粉酶活力。考察培养温度（28、31、34、37、40、43 ℃）、pH值（5、6、7、8、9、10）、摇床转速（170、200、230 r/min）对菌株XC2产淀粉酶的影响。1.5.3菌株XC2生长曲线和产酶曲线的测定使用血球计数板计活菌数，运用芽孢染色法观察菌株生长时期并测定淀粉酶活力，绘制菌株XC2生长曲线和产酶曲线。1.5.4正交试验设计发酵条件优化采用4因素3水平正交试验，每组3个重复。以酶活力为考察指标进行正交试验。1.6数据统计与分析使用SPSS 18.0进行方差分析及差异显著性分析。2结果与分析2.1酶学性质研究2.1.1温度对菌株XC2产淀粉酶活力的影响（见图1）图1温度对菌株XC2产淀粉酶活力的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F1a1（a）反应最适温度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F1a2（b）温度稳定性淀粉酶活力的最大值为100%。由图1（a）可知，淀粉酶反应的最适温度为50 ℃，20~50 ℃时酶活随温度升高而增大，40~60 ℃时相对酶活在90%以上。由图1（b）可知，保温1 h，该淀粉酶30~50 ℃的相对酶活维持在85%以上，60~70 ℃时相对酶活迅速下降。2.1.2pH值对菌株XC2产淀粉酶活力的影响（见图2）图2pH值对菌株XC2产淀粉酶活力的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F2a1（a）反应最适pH值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F2a2（b）pH值稳定性由图2（a）可知，pH值为6时，淀粉酶活力最大，pH值为5时，相对酶活为97%，该淀粉酶反应最适pH值为6。由图2（b）可知，保温1 h，在pH值4~7的范围内，淀粉酶活力高于50%。2.1.3金属离子对菌株XC2淀粉酶活力的影响（见图3）对照组淀粉酶活力为100%。由图3可知，试验所选金属离子中，可以明显促进淀粉酶活力的为Fe2+、Zn2+、Cu2+，抑制淀粉酶活力的为Na+。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F003图3金属离子对菌株XC2产淀粉酶活力的影响2.2菌株XC2发酵条件的优化2.2.1碳源对菌株XC2产淀粉酶的影响（见图4、图5）由图4可知，蔗糖为碳源时，淀粉酶活力显著高于其他碳源（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F004图4碳源对菌株XC2产淀粉酶的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。由图5可知，蔗糖的添加量为0.5%和1.0%时，淀粉酶活力显著高于其他添加量，蔗糖添加量高于1.0%后酶活力逐渐下降（P0.05）。考虑到节省生产成本，因此，选择0.5%蔗糖为菌株XC2产淀粉酶的最佳碳源添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F005图5蔗糖添加量对菌株XC2产淀粉酶的影响2.2.2氮源对菌株XC2产淀粉酶的影响（见图6、图7）由图6可知，菌株XC2不能利用无机氮源，仅添加无机氮源时，菌株无法生长。有机氮源能够被菌株XC2有效利用，培养基中添加牛肉膏为氮源时，淀粉酶活力最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F006图6氮源对菌株XC2产淀粉酶的影响由图7可知，牛肉膏添加量为1.5%时，酶活力最高，添加量降低或增高均会使酶活下降。因此，1.5%的牛肉膏为最佳氮源添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F007图7牛肉膏添加量对菌株XC2产淀粉酶的影响2.2.3金属离子对菌株XC2产淀粉酶的影响（见图8、图9）由图8可知，培养基中添加K+时，菌株XC2产淀粉酶活力最高，Na+、Mg2+次之。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F008图8金属离子对菌株XC2产淀粉酶的影响由图9可知，K+的添加量为0.8%时，菌株产淀粉酶活力最高。因此，0.8%为K+的最佳添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F009图9K+添加量对XC2产淀粉酶的影响2.2.4培养条件对菌株XC2产淀粉酶的影响（见图10~图12）由图10可知，培养温度在37~40 ℃时，淀粉酶活力较高，温度低于37 ℃或高于40 ℃时酶活较低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F010图10培养温度对菌株XC2产淀粉酶的影响由图11可知，培养基初始pH值为7时，淀粉酶活力最高，pH值在5~10时，菌株淀粉酶活力能维持较高水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F011图11初始pH值对菌株XC2产淀粉酶的影响由图12可知，随摇床转速增加，菌株产淀粉酶活力升高。摇床转速为200~230 r/min时，木聚糖酶活力最大。考虑节省能源，选取200 r/min为培养时的摇床转速。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F012图12摇床转速对菌株XC2产淀粉酶的影响2.2.5菌株XC2生长曲线和产酶曲线（见图13）由图13可知，菌株XC2的生长时期分别为：0~6 h时，生长曲线平缓，菌体数量增长处于较慢的迟缓期；7~30 h时，菌体代谢旺盛，菌体数量增长进入较快的对数期；31~38 h时，菌体量进入最大值的稳定期；39~54 h时，菌体数量处于快速下降的衰亡期。菌株XC2淀粉酶活力在培养21 h时达到最大值，13~54 h时，淀粉酶活力维持在较高水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.F013图13菌株XC2的生长曲线和产酶曲线2.2.6正交试验结果在单因素试验的基础上，选取蔗糖添加量（A）、牛肉膏添加量（B）、K+添加量（C）为自变量，L9（34）正交试验因素与水平设计见表1。以酶活力为考察指标，正交试验结果见表2。方差分析结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.T001表1L9（34）正交试验因素与水平设计水平ABC10.51.50.621.02.00.831.53.01.0%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.T002表2正交试验设计及试验结果编号ABCD（空列）酶活力/(U/mL)11110404.021220486.531330525.142120586.852230648.562310585.473130482.083210982.993320966.1k1471.8490.9657.4k2606.9706.0679.8k3810.3692.2551.9R338.5215.1127.910.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.015.T003表3方差分析结果因素SSdfMSF值A913.342456.67902.06B368.572184.28364.01C80.34240.1779.35D197.61298.81195.17误差9.11180.51总变异1 568.9826由表2、表3可知，RARBRC，FAFBFC，即对菌株XC2产淀粉酶能力影响最大的为蔗糖添加量，其次为牛肉膏添加量，K+添加量的影响较小。根据正交试验结果，分别测定培养基配方为A3B2C2（蔗糖添加量1.5%、牛肉膏添加量2.0%、K+添加量0.8%）和A3B2C1（蔗糖添加量1.5%、牛肉膏添加量2.0%、K+添加量0.6%）时淀粉酶活力大小。根据最优配方培养菌株后测定，经验证试验证明最优培养基组合为A3B2C1，淀粉酶活力达984.5 U/mL。3讨论本研究中，目标菌株Bacillus subtilis XC2筛选自青藏高原高寒草甸土壤，Bacillus subtilis菌株能够产生蛋白酶，有较强的产淀粉酶能力[17]。研究表明，芽孢杆菌是工业产酶制剂的常用菌株，有较好的抗逆性，能产生多种酶类，如蛋白酶、淀粉酶脂肪酶及纤维素酶等[18-19]。其中，枯草芽孢杆菌是产淀粉酶的重要菌株[20]。阎华等[21]从酿酒厂下水道污泥分离出产淀粉酶菌株短小芽孢杆菌HB-3，在淀粉培养基上培养72 h，发现淀粉酶活力达到120.0 U/mL。刘延波等[22]从赊店老酒大曲中分离出1株具有较强的产淀粉酶能力的菌株，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），通过响应面优化后产酶能力达到164.4 U/mL。赵淑琴等[23]从土壤中筛选出1株高产淀粉酶菌株LZ-10，优化后酶活力达41.6 U/mL。本试验探究菌株XC2产淀粉酶酶学性质，结果表明，该淀粉酶的反应最适温度为50 ℃，最适反应pH值为6.0，在30~50 ℃和pH值4.0~7.0时酶活稳定性较好，Fe2+、Cu2+、Zn2+对酶活有促进作用，Na+对酶活有抑制作用，优化后酶活力达984.5 U/mL。4结论试验研究发现，Bacillus subtilis XC2产淀粉酶最佳条件为蔗糖浓度1.5%、牛肉膏浓度2.0%、K+浓度0.6%、培养温度37 ℃、转速200 r/min、初始pH 7.0、发酵时间21 h。优化后该菌株产淀粉酶活力可达到984.5 U/mL。本研究为淀粉酶酶制剂工业高产菌株资源的开发应用提供参考。