植物甾醇又称植物固醇，广泛存在于植物的根、果实、叶子等部位，主要活性成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇，是我国允许应用于动物饲料生产的饲料添加剂[1]。植物甾醇的主要功能包括：类雌激素活性、调节免疫、降低胆固醇、抗炎、抗氧化、促生长及抗病毒活性等[2]。植物甾醇对猪[3]、鸡[4]、鹌鹑[5]等动物均具有促进生长和提高瘦肉率的作用，而Wnt1基因通过Wnt/β-catenin信号通路影响成肌细胞分化是其作用于瘦肉率和脂肪沉积的重要途径[6]。本试验通过对育肥猪饲喂不同添加量的植物甾醇，观察其生长性状、胴体性状、免疫指标的作用，结合对不同组织中Wnt1基因的表达量的影响，研究植物甾醇对育肥猪生产性能改善的作用机制。1材料与方法1.1试验材料本试验所用植物甾醇购自广东蔚来生物科技有限公司，其中植物甾醇的有效含量见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.004.T001表1植物甾醇有效成分含量项目含量总甾醇≥95β-谷甾醇≥30豆甾醇≥10菜油甾醇≥10%1.2试验设计本研究的试验动物为“杜×长×大”三元猪，试验猪健康状况一致，总计240头，公、母各半，体重约为90 kg。按公、母各半的原则，将试验猪随机分为4组，每组6个重复，每个重复10头试验猪。分别在4组试验猪日粮（由临沂欧维美饲料有限公司生产）中添加0、100、200、300 g/t植物甾醇，按照植物甾醇添加量依次命名为A（对照组）、B、C、D组。基础日粮组成及营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.004.T002表2基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100玉米67消化能/(MJ/kg)≥13.45豆粕8粗蛋白/%≥15.38小麦麸21钙/%≥0.79预混料4总磷/%≥0.73赖氨酸/%≥0.60蛋氨酸+色氨酸/%≥0.45精氨酸/%≥0.47注：1.每千克预混料为日粮提供：VA 65 000 IU、VD3 50 000 IU、VE 275 mg、VK3 12.5 mg、VB1 24 mg、VB2 50 mg、VB6 25.5 mg、VB12 0.12 mg、叶酸 7.5 mg、生物素1.25 mg、烟酸/烟酰胺300 mg、泛酸钙140 mg、锰800 mg、铁1 500 mg、锌1 300 mg、铜310 mg、碘8 mg、硒4.2 mg。2.营养水平均为计算值。1.3饲养管理试验始于2020年11月21日，饲喂试验持续50 d，试验开始前对猪舍进行全方位清洗、消毒，试验期间按照养殖场内的日常管理对育肥猪进行治疗和驱虫，保证猪自由采食与饮水。饲养人员严格执行防疫制度，对试验猪的情况各项数据进行统计，发现疾病及时处理。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能试验人员每日记录各重复育肥猪的采食量，在试验开始与结束时对猪进行空腹称重，计算试验阶段各重复的平均日增重（ADG）、日平均采食量（ADFI）及料重比（F/G）。ADG=(末重-初重)/试验天数(1)ADFI=试验阶段总采食量/试验天数(2)F/G=(末重-初重)/试验阶段总采食量(3)1.4.2胴体性状试验结束时，每个重复中随机选择1头试验猪屠宰，本试验主要检测胴体性状为背膘厚（BF）和眼肌面积（LMA），测定方法根据NY/T 825—2004《瘦肉型猪胴体性状测定技术规范》执行。1.4.3免疫指标测定胴体性状前对用于屠宰的试验猪前腔静脉采血，每头试验猪采集5 mL血样并标记。血样于常温条件下静置15 min，3 000 r/min离心20 min，取上清液置于-80 ℃冰箱中保存。试验猪屠宰完毕，迅速取背最长肌、肝脏等样品置于液氮中，置于-80 ℃冰箱中保存。主要测定血清中IgA、IgG、IgM的含量（上海原鑫生物科技有限公司）。1.4.4抗氧化指标测定血清中总抗氧化能力（T-AOC）、总过氧化物歧化酶（T-SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）含量（上海原鑫生物科技有限公司），具体操作按照试剂盒上说明书进行。1.4.5肌肉与肝脏中Wnt1基因的表达量测定以β-actin作为内参照，检测背最长肌、肝脏中Wnt1基因的mRNA的表达水平。使用Trizol法提取和分离样品中的总mRNA，通过逆转录试剂盒（Thermo Fisher公司）将RNA转化为cDNA。加入引物（详细序列见表3）和Taq聚合酶，使用Bio-Rad CFX Manager real-time PCR仪（Bio-Rad公司）进行定量分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.004.T003表3基因引物设计信息基因引物序列引物长度/bp扩增长度/bpGenBank登录号β-actin上游：TCTGGCACCACACCTTCT下游：TGATCTGGGTCATCTTCTCAC上游：18下游：21114NM_214313.2Wnt1上游：CCAACTTCTGCACATACAGCG下游：CACCAGTGGAAGGTGCAGTTG上游：21下游：21169XM_003126100.51.5数据统计与分析Wnt1基因的表达量均以β-actin为内参基因，最终以相对表达量的数据表示，相对荧光定量计算方法为Pfaffl方法[7]。所有数据使用Excle进行初步整理，采用SAS 9.2进行统计处理，结果以“平均值±标准差”表示，使用Duncan's法进行多重比较。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1植物甾醇对育肥猪生产性能的影响2.1.1植物甾醇对育肥猪生长性状的影响（见表4）由表4可知，B、C、D组试验猪末重显著高于对照组（P0.05），ADG、ADFI均极显著高于对照组（P0.01），F/G显著低于对照组（P0.05）。但C、D两组间无显著差异，且对生长性状的改善幅度有所减缓，说明植物甾醇超过一定添加量后，对养殖经济效益的提升速度减缓。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.004.T004表4植物甾醇对育肥猪生长性状的影响项目A组B组C组D组初重/kg91.34±0.4890.28±0.3290.88±0.4791.01±0.26末重/kg130.84±0.81b137.28±1.38a138.88±1.12a141.51±1.38aADG/kg0.79±0.02C0.85±0.01B0.96±0.03A1.01±0.02AADFI/kg2.87±0.04D2.98±0.03C3.26±0.05B3.41±0.04AF/G3.63±0.08a3.51±0.04b3.40±0.06c3.38±0.11c注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.1.2植物甾醇对育肥猪胴体性状的影响（见表5）由表5可知，随着植物甾醇的添加量增大，各试验组的LMA极显著升高（P0.01），表明植物甾醇对猪胴体性状有显著的改善作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.004.T005表5植物甾醇对猪胴体性状的影响项目A组B组C组D组BF/mm36.32±1.3835.86±1.9137.33±2.0836.87±1.49LMA/cm245.23±1.33D49.06±2.89C54.82±5.33B59.01±3.15A2.2植物甾醇对猪血液指标的影响2.2.1植物甾醇对血清免疫指标的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，试验组育肥猪的血清IgA含量显著升高（P0.05），IgG含量极显著升高（P0.01），IgM含量差异不显著（P0.05）。表明植物甾醇可以提高育肥猪机体免疫性能。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.004.T006表6植物甾醇对血清免疫指标的影响项目A组B组C组D组IgA/(g/L)0.35±0.12b0.41±0.23a0.40±0.33a0.43±0.38aIgM/(g/L)1.37±0.231.32±0.581.40±0.471.38±0.29IgG/(g/L)1.82±0.36B3.21±0.48A3.10±0.56A3.23±0.88A2.2.2植物甾醇对猪血清抗氧化能力的影响（见表7）由表7可知，与对照组相比，试验组育肥猪血清T-SOD活性极显著升高（P0.01），GSH-Px活性、T-AOC显著升高（P0.05），血清MDA含量显著降低（P0.05）。结果表明，植物甾醇可以有效提高育肥猪血清抗氧化能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.004.T007表7植物甾醇对猪血清抗氧化指标的影响项目A组B组C组D组T-SOD/(U/mL)153.48±10.21Cd198.33±9.83Bc289.34±11.38Ab300.18±11.30AaGSH-Px/(U/mL)233.12±12.34d278.13±11.03c308.65±10.86b320.12±15.42aT-AOC/(U/mL)1.63±0.22d1.78±0.34c1.89±0.47b2.20±0.31aMDA/(μmol/L)5.81±0.25a5.30±0.37b4.82±0.17c4.27±0.47d2.3植物甾醇对肌肉与肝脏中Wnt1基因相对表达量的影响（见图1、图2）由图1、图2可知，与对照组相比，肝脏与背最长肌中Wnt1基因的相对表达量在试验组中均极显著高于对照组（P0.01），并且随着植物甾醇添加量的升高呈上升趋势，但C、D组肝脏与背最长肌的Wnt1基因的相对表达量差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.004.F001图1植物甾醇对育肥猪肝脏Wnt1基因相对表达量的影响注：不同字母表示差异极显著（P0.01），相同字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.004.F002图2植物甾醇对育肥猪背最长肌Wnt1基因相对表达量的影响3讨论3.1植物甾醇对动物生产性能的影响植物甾醇作为饲料添加剂具有提高动物生产性能的作用。Hu等[8]将120头体重约9.5 kg的断奶仔猪随机分为3组，每组6头，分别设置为空白组，植物甾醇组（植物甾醇添加量为200 g/t），polymyxin E组（多黏菌素E添加量为40 g/t），试验结束时发现，植物甾醇组与polymyxin E组腹泻率显著低于空白组，可以提高猪的生长速度。吴先华等[9]在育肥猪日粮中添加0、50、100、150、200 mg/kg植物甾醇，结果表明，与对照组相比，150、200 mg/kg组的ADFI分别提高5.14%和6.54%，ADG分别提高10.29%和14.71%；F/G分别比对照组降低5%和7.3%，上述研究与本试验结论基本一致，但由于植物甾醇的生产工艺和主要活性成分不同，因此对生长性能的促进作用可能存在差异。3.2植物甾醇对血液指标的影响3.2.1植物甾醇对育肥猪抗氧化能力的影响Chen等[10]在研究中认为，植物甾醇可以清除超氧负离子和羟基自由基，具有较强的抗氧化作用，其抗氧化能力与所处温度以及反应时间有关。Zhao等[11]在肉鸡日粮中分别添加0、20、40、80 mg/kg的植物甾醇，观察其对肉鸡生产性能与抗氧化性能的影响，结果表明，植物甾醇对肉鸡生产性能的影响呈曲线增长趋势；随着植物甾醇添加量增高，试验第21 d和50 d，血清中GSH-Px活性显著提高，且21 d肝脏中GSH-Px与SOD活性显著提高；植物甾醇还可以显著降低屠宰后肌肉的滴水损失，综合生产性能、抗氧化性能及屠宰性能考虑，该研究认为40 mg/kg为植物甾醇在肉鸡日粮中的最优添加量。杨丽[12]在植物甾醇对断奶仔猪的影响研究中认为，随着植物甾醇的使用时间延长，植物甾醇对猪体内抗氧化能力的影响会逐步减弱，与空白组无显著差异。植物甾醇是混合物，提取原料较为广泛，不同植物甾醇产品中β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等活性物质比例不完全一致，可能是导致研究结论存在差异的原因，但大部分研究认为植物甾醇可以提高动物体内的抗氧化能力。3.2.2植物甾醇对育肥猪免疫功能的影响植物甾醇可以降低TNF-α、hs-CRP（超敏反应C蛋白）和IL-6在机体中的含量，促进外周淋巴细胞增殖，还与氢化可的松和泼尼松等具有相似功能，而豆甾醇也具有一定的消炎功能，从而调节机体免疫功能[13]。吴先华等[9]研究结果认为，50、200 mg/kg组血清白蛋白分别比对照组提高10.16%和7.97%，血清球蛋白分别提高11.57%和9.25%，间接说明植物甾醇可以提高育肥猪的免疫能力。扈添琴等[14]利用植物甾醇与酶制剂复合产品分别在奶牛日粮中添加0（对照组）、0.1%（试验Ⅰ组）、0.2%（试验Ⅱ组）和0.5%（试验Ⅲ组），结果表明，试验Ⅱ组和试验Ⅲ组的血清GSH-Px活性高于对照组，显著高于试验Ⅰ组；试验Ⅲ组的血清IgG水平显著高于对照组，极显著高于试验Ⅰ组，因此认为植物甾醇具有增强机体抗氧化和免疫能力的效果。3.3植物甾醇对育肥猪组织中Wnt1基因表达的影响Wnt/β-catenin信号通路参与肌肉合成与脂肪沉积[15]，Wnt1信号与脂肪细胞表面的受体结合并激活通路时，β-catenin可以释放并协助T细胞因子转位进入细胞核，通过转录下调PPARγ和C/EBPα而抑制脂肪细胞分化，进而降低脂肪沉积。Cai等[6]在研究中认为，降低Wnt1的mRNA和蛋白质水平可以影响肌细胞分化，Wnt1的表达量对促进肌肉合成与降低脂肪沉积具有重要影响。本研究中，随着植物甾醇添加量提高，背最长肌和肝脏中Wnt1基因的表达量逐渐增加，结合LMA的测定结果，说明植物甾醇可能通过促进Wnt1表达提高猪瘦肉率。4结论植物甾醇可以改善育肥猪生长性能，增强免疫性能和抗氧化性能，促进Wnt1基因表达，效果随着植物甾醇的使用量提高而提升。根据测定结果并综合饲料生产成本，建议在育肥猪全价配合饲料中添加100~200 g/t植物甾醇。