伏马毒素是串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）等镰刀菌产生的1种水溶性代谢产物[1]，广泛存在于各种饲料原料及饲料产品中，不仅降低了饲料的营养价值，还会使饲料结块、变色，影响适口性[2-3]。饲料中的伏马毒素也会储存于畜禽体内，损伤畜禽的心、肾、肺等器官，轻则对人体和动物体产生神经毒性、肺毒性、免疫抑制和胚胎毒性等，重则危及生命，对养殖业造成了严重的经济损失[4-6]。《GB 13078—2017饲料卫生标准》中规定了各饲料原料与饲料产品中伏马毒素的限量值为5~60 mg/kg[7]，如何降低饲料中伏马毒素也成为当今研究的热点问题。随着科学技术的发展，伏马毒素的去除大致分为物理削减法、化学削减法和生物降解法[8]。传统的物理和化学脱毒方法处理饲料产品中的霉菌毒素具有局限性，可能造成营养物质流失、试剂残留、对环境的二次污染等。而生物降解法为有效去除霉菌毒素提供了新的研究思路，利用微生物生长过程中产生的次级代谢产物或胞外酶，可将霉菌毒素分子的生物基团分解破坏，并转化为无毒的代谢产物[9]。该方法不仅能够高效地将毒素转化为无毒、环保、安全的产品，且具有特异性强、转化效率高、不损伤营养物质的优点[10]。但是近年来，研究大多集中在筛选降解伏马毒素的菌株[11-13]，对筛选拮抗镰刀菌生长减少伏马毒素产生的试验较少，二者兼顾的更是鲜有报道。本研究拟筛选1株高效降解伏马毒素且拮抗串珠镰刀菌的芽孢杆菌，旨在应用于发酵饲料行业，既可以抑制串珠镰刀菌的生长并减少伏马毒素的产生，又可以降解饲料中已有的伏马毒素。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试菌株芽孢杆菌菌株、串珠镰刀菌，保存于河北农业大学缉毒大队工作室。1.1.2试验试剂伏马毒素标准品购自北京美正检测技术有限公司；酶联免疫快速检测试剂盒购自北京华安麦科生物科技有限公司。1.2试验方法1.2.1串珠镰刀菌拮抗菌的筛选将串珠镰刀菌接种于PDB培养基，28 ℃培养48 h，按1%的比例加入PDA培养基中，混匀，制备成串珠镰刀菌病原菌平板。将实验室4 ℃冰箱保藏的芽孢杆菌菌株活化，采用十字划线法点接于病原菌平板上，28 ℃培养48 h，观察菌株的拮抗效果。将具有拮抗效果的菌株接种到NB培养基中，37 ℃培养48 h，发酵液8 000 r/min离心10 min，取200 μL上清液加入病原菌平板的点样孔中，28 ℃培养48 h，观察透明圈的有无及大小。1.2.2伏马毒素降解菌的筛选取对串珠镰刀菌有拮抗活性的菌株发酵液1.0 mL，8 000 r/min离心10 min得上清液，伏马毒素按1%的比例添加至发酵上清液中，使伏马毒素的终浓度为1.0 mg/L，37 ℃、180 r/min的摇床培养72 h。使用酶联免疫法检测伏马毒素含量的变化，对照为只添加伏马毒素的发酵培养基。降解率=(空白值-试验组残留值)/空白值×100%(1)1.2.3功能菌株的种属鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[14]进行菌株形态学观察和生理生化试验。通过PCR技术对菌株16S rDNA进行扩增，将PCR产物送往华大基因股份有限公司进行测序，将测序结果进行同源性比较，建立系统发育树，初步确定种属。1.2.4功能菌株对伏马毒素的降解特性研究1.2.4.1菌株在不同作用时间的降解率取菌株发酵上清液0.5 mL，加入伏马毒素保证终浓度为1.0 mg/L，180 r/min、37 ℃摇床培养，分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h时测定伏马毒素降解率，以确定菌株的最佳降解时间。1.2.4.2菌株在不同pH值下的降解率取菌株发酵上清液0.5 mL，加入伏马毒素使其终浓度为1.0 mg/L，然后分别调节pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。37 ℃、180 r/min摇床培养72 h，测定伏马毒素降解率，以确定菌株的最适降解pH值。1.2.4.3菌株在不同温度下的降解率取菌株发酵上清液0.5 mL，加入伏马毒素使其终浓度为1.0 mg/L，分别置于25、28、37、42 ℃下180 r/min摇床处理72 h，测定伏马毒素降解率，以确定菌株的最适降解温度。2结果与分析2.1串珠镰刀菌拮抗菌的筛选（见图1）结合十字划线法和平板扩散法得到20株能够抑制串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）生长的菌株。由图1可知，部分菌株出现拮抗现象。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.014.F001图1串珠镰刀菌拮抗菌的筛选2.2伏马毒素降解菌的筛选（见表1）通过菌株发酵液离心上清液与伏马毒素共培养得到6株菌具有降解伏马毒素的活性，由表1可知，降解率在10%~100%之间，其中菌株R3-7降解率最高，达到98.92%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.014.T001表1伏马毒素降解菌株的筛选菌株名称样品来源降解率/%A14仔猪粪便12.80Y-1d玉米秸秆53.80SD1仔猪粪便51.20A15耕种土壤67.20C1-2杂草土壤75.20F2发酵苜蓿79.54R3-7饲料贮藏土壤98.922.3功能菌株的种属鉴定2.3.1形态学观察（见图2）由图2可知，菌株R3-7菌落为乳白色，表面有褶皱、不透明、边缘整齐，中间隆起。革兰氏染色阳性菌，无荚膜、菌体呈小杆状、芽孢呈杆状。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.014.F002图2菌株R3-7的菌落特征和菌体形态2.3.2分子生物学鉴定（见图3）由图3可知，将菌株R3-7的16S rDNA序列与GenBank中已注册的16S rDNA序列用Blast程序进行序列相似性比较分析，并构建系统发育树，菌株R3-7与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）聚在一起。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.014.F003图3菌株R3-7的系统发育树2.3.3生理生化鉴定（见表2）结合菌株16S rDNA序列分析结果，参考《常用细菌鉴定手册》对菌株R3-7进行生理生化鉴定试验。由表2可知，综合形态学观察、生理生化试验、分子生物学鉴定，最终确定该菌为枯草芽孢杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.014.T002表2菌株R3-7的生理生化试验项目结果项目结果吲哚的产生-革兰氏染色+V-P+产酸L-阿拉伯糖+硝酸盐还原+接触酶+乳糖-柠檬酸盐的利用+明胶液化+丙酸盐的利用-酪氨酸水解-产酸D-葡萄糖+产酸D-甘露醇+产酸D-木糖+注：+表示阳性；-表示阴性。2.4功能菌株对伏马毒素的降解特性研究2.4.1不同作用时间对伏马毒素降解率的影响（见图4）由图4可知，菌株R3-7对伏马毒素的降解率在7 h后成线性上升趋势，降解率在9 h时达到最高，9 h后降解率达到稳定期。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.014.F004图4不同作用时间对伏马毒素降解率的影响2.4.2不同pH值对伏马毒素降解率的影响（见图5）由图5可知，随着pH值的下降，菌株降解活性开始降低，pH值为5.0时其降解率约5%，表明在低pH值时菌株生长速度缓慢，代谢产物也相应减少，导致降解率下降。在pH值为7.0时，降解率最高，为91.28%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.014.F005图5不同pH值对伏马毒素降解率的影响2.4.3不同温度对伏马毒素降解率的影响（见图6）由图6可知，在温度较低或较高时菌株生长速度比较缓慢，代谢产物减少，降解率也会下降。在37 ℃时，菌株降解率最高，为81.05%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.014.F006图6不同温度对伏马毒素降解率的影响3讨论农业生产中的常见致病菌是镰刀菌[15]，伏马毒素作为其次级代谢产物影响颇大，如何高效去除伏马毒素已经成为农业、畜牧业迫切需要解决的问题。化学降解法消除伏马毒素已经被欧盟明令禁止，而与物理法相比，生物降解法不会影响饲料的品质[16]。生物降解法应用范围广，实际操作更方便，微生物的代谢活动在生产中还会提高原料的营养价值，国内外众多研究者均将它作为研究热点。目前，国内外已经有研究者在伏马毒素微生物降解方面取得了阶段性的进展。Heinl等[17]报道了1株降解伏马毒素B1的鞘氨醇单胞菌ATCC55552，并获得其降解酶。杨朋飞等[18]从污泥样品中筛选出1株鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis sp.），该菌株对伏马毒素具有高效的降解能力。Zhao等[19]从废弃蘑菇堆肥中分离到1株具有伏马毒素B1强降解活性的混合菌群SAAS79，并确定假单胞菌属为关键降解成员。但这些菌并未收录于《饲料添加剂品种目录（2013）》中，不能直接应用于饲料或畜牧养殖行业，应对其降解酶进一步开发。本研究筛选到1株能够降解伏马毒素、抑制串珠镰刀菌的生长的菌株R3-7，经鉴定为枯草芽孢杆菌，可以直接用于饲料和养殖行业。液体培养条件下，菌株R3-7对伏马毒素的降解率能够达到98.92%，在目前的报道中降解率较高。菌株R3-7对串珠镰刀菌的生长具有拮抗作用，在青贮或发酵饲料使用过程中可以起到防治结合的效果。研究发现，随着时间的增加，菌株R3-7对伏马毒素的降解率逐渐增加，在9 h时到达最大，说明该菌株能够高效降解伏马毒素。菌株R3-7能够在25~42 ℃时均具有较高的降解率，说明该菌株可在不同的温度下起作用。菌株R3-7在pH值为6、7时有较高的降解率，且pH值为7时的降解率最高，说明该菌株作用于发酵偏酸性或碱性的饲料时应调节pH值才能够更好地发挥作用。4结论试验筛选到1株既拮抗串珠镰刀菌生长又降解伏马毒素的枯草芽孢杆菌R3-7。菌株R3-7对伏马毒素的最佳降解时间为9 h，最适降解pH值为7.0，最适降解温度为37 ℃。