妊娠期是哺乳动物重要的生理过程，妊娠期营养摄入是影响母婴健康最重要的因素之一。妊娠期间营养供给不足直接影响雌性动物繁殖性能的发挥，严重时可能会引起妊娠并发症以及不良妊娠，甚至导致母牛死亡，影响胚胎的生长发育和成年后的健康状况[1-2]。我国是世界上主要的牦牛种质资源库和牦牛畜产品生产区[3]。我国牦牛主要分布在新疆、西藏、青海、甘肃、四川和云南等地，约有1 400万余头，占世界牦牛总数的95%以上。青海作为牦牛资源最集中的地区之一[4]，现有牦牛存栏量高达480.97万头，位居全国首位，约占世界总数的32%[5]。牦牛常年生活在海拔3 000~5 000 m的高寒、高海拔青藏高原地区。青藏高原高寒、缺氧、昼夜温差大，牧草枯草期长达半年，而牦牛妊娠期正处于枯草期，期间营养物质摄入量无法得到保证[6]。目前，有关牦牛的代谢及营养相关的研究大都集中于牦牛生长期[7-8]，对牦牛妊娠期的相关研究较少。在妊娠后期中，胎儿机体组织发育较快，对养分需要量增加。因此，本研究选取妊娠后期牦牛为研究对象，探究不同饲喂水平对妊娠期牦牛瘤胃发酵、血清生化指标和生殖激素的影响，为进一步研究牦牛不同生理阶段的适度补饲提供参考。1材料与方法1.1试验动物本试验于2018年9月至2019年4月在青海省大通种牛场进行，选取体况良好、体重（250±30）kg的3~5胎经产大通母牦牛15头，进行同期发情处理并本交配种，经妊娠检查确定后进行试验。将15头母牦牛按体重随机分为3个处理组：自由采食组（AL）、80%采食组（IR80）和60%采食组（IR60），采用梯度法进行饲喂。1.2试验设计参照生长期牦牛能量蛋白需要量[7-8]和肉牛饲养标准（2004）[9]制定体重为250 kg妊娠期牦牛的日粮配方。采用精料与粗料分开饲喂的方式进行饲喂，其中精料由湟源县河湟清牧饲料有限公司加工生产（精饲料直径6 mm、长10 mm）。粗料为粉碎后的燕麦青干草，粉碎长度为3~5 cm。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.002.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00燕麦青干草50.00总能/(MJ/kg)18.09玉米41.50干物质/%91.50小麦麸2.50有机物质/%85.10菜籽油2.50粗蛋白质/%7.70豆粕0.50粗脂肪/%5.00菜粕0.50中性洗涤纤维/%17.20磷酸氢钙1.00酸性洗涤纤维/%32.40食盐0.50钙/%6.64膨润土0.50磷/%0.46预混料0.50注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 3000 IU、VD3 300 IU、VE 50 IU、烟酸50 mg、铁48 mg、铜12 mg、锰20 mg、锌20 mg、硒0.3 mg。2.营养水平中总能为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理整个饲养试验期间，试验牛采用单栏饲喂的方式，每天早晚（8：00和17：00）各饲喂1次，精料与燕麦干草分开饲喂（先精后粗），牦牛自由饮水。根据前1 d的AL组牦牛采食量对当天饲喂量进行调整，确保饲槽内剩余草料有不低于10%，IR80组和IR60组每天的饲喂量是前1 d的AL组实际采食量的80%和60%。1.4测定指标及方法1.4.1瘤胃发酵参数使用瘤胃液采集管经口腔采集瘤胃液，4层纱布过滤，获取滤液。取10 mL立即测定其pH值，另外采集50 mL并分装于15 mL离心管内用于瘤胃液氨态氮（NH3-N）、挥发性脂肪酸（VFA）、总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度的测定，置于-20 ℃冰箱保存。采用HANNA HI 221型台式酸度计测定瘤胃液的pH值。采用冯宗慈等[10]改进的比色法测定瘤胃液氨态氮浓度。参考毕思思[11]的方法，使用岛津GC-2014气相色谱仪测定瘤胃液挥发性脂肪酸的浓度。1.4.2血清生化指标和生殖激素使用真空采血管从试牛颈静脉采血5 mL，离心机离心10 min，取上层血清于冻存管中，-20 ℃保存，用于测定血清生化指标和生殖激素。测定的血清生化指标包括：葡萄糖、总蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素氮（BUN）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、钙以及碱性磷酸酶（ALP）。生殖激素指标包括：卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P4）、催乳素（PRL）等。血清生化指标送至青海省人民医院检测，生殖激素均采用试剂盒检测，试剂盒均购自江苏酶标生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书的方法进行检测。1.5数据统计与分析采用Excel对数据进行整理，使用SPSS 20.0软件进行数据独立性、正态性和方差齐性检验，进行ANOVA单因素方差分析，差异显著时采用Duncan's法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同饲喂水平对妊娠期牦牛瘤胃发酵指标的影响（见表2）由表2可知，妊娠180 d时，IR60组试牛瘤胃pH值显著高于AL组和I80组（P0.05），同时IR60组牦牛妊娠后期瘤胃液pH值数值也显著高于其他2组（P0.05）；妊娠150 d时，IR60组试验组的牦牛瘤胃液的NH3-N浓度显著高于其他两组（P0.05），随着妊娠天数的增加，3组牦牛瘤胃液NH3-H的浓度均显著升高（P0.05）；饲喂水平对妊娠期牦牛瘤胃液中乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸含量无显著影响，但在妊娠220 d时，IR60组牦牛丁酸的含量显著低于其他2组（P0.05），妊娠期丁酸的含量整体呈下降的趋势，其中IR60组牦牛3个试验时间点之间丁酸含量下降最为显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.002.T002表2不同饲喂水平对妊娠期牦牛瘤胃发酵指标的影响组别妊娠天数/dpH值氨态氮/(mg/L)乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)丁酸/(mmoL/L)总挥发性脂肪酸/(mmol/L)AL组1507.15±0.3124.1±3.6Cb43.73±8.238.08±1.226.26±1.1959.64±10.701807.28±0.03b41.5±3.4B41.28±5.317.64±1.304.95±0.3355.39±7.162207.26±0.08b75.3±6.0A42.34±8.818.97±1.685.64±1.17a58.79±7.20IR80组1507.15±0.0617.4±5.1Cc44.22±5.288.29±0.166.67±0.7760.76±6.291807.30±0.09b52.1±6.7B45.90±8.118.28±1.406.19±1.8561.96±12.702207.24±0.10c75.0±11.8A41.82±0.258.47±0.445.77±0.40a57.74±0.98IR60组1507.22±0.10B29.4±3.3Ca44.23±8.727.82±1.046.22±1.29A60.02±10.721807.44±0.05Aa49.2±8.3B34.87±3.716.52±0.574.27±0.31B47.06±4.722207.42±0.04Aa68.7±8.1A38.00±6.517.48±0.893.77±0.41Bb50.78±7.63注：同列数据肩标小写字母不同表示相同天数下饲喂水平间差异显著（P0.05），同列数据肩标大写字母不同表示同饲喂水平下不同天数间差异显著（P0.05）；下表同。2.2不同饲喂水平对妊娠期牦牛血清生化指标的影响（见表3）由表3可知，饲喂水平对妊娠期牦牛血清生化指标影响较小。妊娠220 d时，AL组牦牛血清葡萄糖含量显著高于其他2组（P0.05）。整个妊娠期内，试验牛血液中葡萄糖含量先增加后降低，且同饲喂水平下不同时间点间差异显著（P0.05）；AL组和IR80组牦牛血清中谷丙转氨酶含量均显著高于IR60组牦牛（P0.05）；整个妊娠期牦牛血清中尿素氮（1.89~2.50 mmol/L）含量处于较低状态。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.002.T003表3不同饲喂水平对妊娠期牦牛血清生化指标的影响组别妊娠天数/d葡萄糖/(mmol/L)总蛋白/(g/L)白蛋白/(g/L)球蛋白/(g/L)尿素氮/(mmol/L)谷丙转氨酶/(U/L)谷草转氨酶/(U/L)总胆固醇/(mmol/L)甘油三酯/(mmol/L)钙/(mmol/L)碱性磷酸酶/(U/L)AL组1503.72±0.34B76.80±4.0531.27±2.4145.53±4.542.16±0.4634.00±3.46a81.33±10.212.63±0.270.30±0.032.05±0.0395.00±15.591804.75±0.41A76.27±6.2131.80±4.9644.47±3.892.00±0.2737.33±8.74a78.00±18.252.93±0.380.23±0.042.12±0.16103.00±28.662204.13±0.16Ba84.10±5.1034.53±2.5749.57±6.732.50±0.7433.33±1.53a83.00±15.722.72±0.280.49±0.102.13±0.16105.67±20.38IR80组1503.45±0.44B74.93±1.4633.33±1.4341.60±2.472.35±0.8436.33±2.31a72.67±3.052.52±0.510.26±0.092.19±0.0961.00±8.661804.27±0.33A77.33±4.5133.50±0.4643.83±4.562.28±0.5835.67±3.79a70.67±14.642.50±0.620.24±0.092.22±0.0967.67±4.742203.67±0.10ABb81.60±4.6932.80±1.5648.80±5.302.17±0.4133.33±1.15a72.67±0.582.42±0.560.31±0.122.17±0.0664.33±7.09IR60组1503.62±0.15B79.43±6.7131.20±1.0448.23±7.752.16±0.2825.33±4.51b87.67±12.602.60±0.230.29±0.092.11±0.0983.33±15.941804.33±0.27A76.27±5.9531.87±1.4444.40±7.361.89±0.6526.33±6.51b73.67±3.512.50±0.180.24±0.112.11±0.0790.00±22.912203.83±0.15Bb80.43±7.0932.40±1.3548.03±8.302.31±0.5427.00±2.65b87.33±16.842.53±0.100.40±0.152.11±0.0486.33±12.772.3不同饲喂水平对妊娠期牦牛生殖激素的影响（见表4）由表4可知，低饲喂水平日粮使妊娠期牦牛血清中生殖激素的含量显著降低。AL组和IR80组牦牛血清中FSH含量在妊娠150~180 d有上升趋势，LH在180~220 d时有上升的趋势；而IR60组FSH和LH含量与另外两组相比较偏低，FSH在妊娠180 d、LH在220 d时显著低于其他两组（P0.05）。在妊娠220 d时，IR60组试牛血清中E2含量为63.92 pmol/L，显著低于AL组（P0.05）。IR60组试牛血清中P4含量在妊娠150 d时显著低于AL组（P0.05），PRL含量150 d时显著低于IR80组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.002.T004表4不同饲喂水平对妊娠期牦牛生殖激素的影响组别妊娠天数/dFSH/(μg/L)LH/(ng/L)E2/(pmol/L)P4/(nmol/L)PRL/(μg/L)AL组1502.96±0.9336.31±9.86B97.08±26.761.41±0.23a179.86±77.56ab1804.14±0.83a32.32±9.97B98.66±26.701.40±0.36207.98±77.912203.59±1.2348.33±10.78Aa115.02±30.40a1.45±0.41264.56±108.73IR80组1502.71±1.5237.98±10.80103.41±32.161.20±0.28ab217.74±61.77a1804.71±1.92a35.98±10.4499.59±28.211.42±0.45233.59±76.372204.74±1.6847.38±18.24a102.42±35.21ab1.64±0.51290.94±108.17IR60组1502.20±0.20C28.36±1.73A69.82±9.870.91±0.07b139.18±18.49b1802.61±0.30Bb22.88±6.22B67.04±6.710.95±0.10144.27±11.422203.47±0.62A24.79±3.47ABb63.92±8.50b0.93±0.19159.85±33.313讨论3.1不同饲喂水平对妊娠期牦牛瘤胃发酵的影响瘤胃液pH值、NH3-N浓度和挥发性脂肪酸产量等参数是评价瘤胃发酵类型和瘤胃健康状况的重要指标。本试验中，氨态氮浓度随妊娠天数增加有升高趋势。研究表明，妊娠后期母体氮需要量增加明显，而饲料提供的氮源有限，当饲料氮含量不足时，母体会加强自身氮源分解并增加尿素氮进入瘤胃的含量，使得瘤胃氨态氮浓度升高[12]。瘤胃内的挥发性脂肪酸直接影响反刍动物的瘤胃健康和微生物区系[13]。本研究发现，妊娠180 d时，IR60组试牛瘤胃pH值高于其他两组，乙酸、丙酸和丁酸的含量低于其他两组，且随妊娠期增加，IR60组试牛丁酸含量随之降低。这与黄文明[14]发现低能日粮提高奶牛产前的瘤胃液pH值的结果一致。当瘤胃养分不充足时，瘤胃微生物活性受到抑制[15]。也有研究表明，日粮中的营养水平直接影响瘤胃内挥发性脂肪酸的含量[16]，限饲可能是IR60组试牛瘤胃各类挥发性脂肪酸含量低的原因。β-羟丁酸为机体肌肉组织提供能量[17]，β-羟丁酸还用于脂肪组织和乳腺组织的脂肪酸合成，妊娠期中后期，母体乳腺发育加快，对丁酸的吸收速率增强，这可能是妊娠期瘤胃丁酸含量降低的原因。3.2饲喂水平对妊娠期牦牛血清生化指标的影响血清生化指标常用来反映动物生理、病理和动物机体营养健康状态。张帆[18]研究表明，采食量受限后，妊娠后期母羊血液中葡萄糖的含量显著降低，本试验也得到相同的结果，在妊娠中后期，胎盘与胎儿的重量迅速增加，对能量的需要量明显增大。Prior等[19]研究发现，妊娠后期氧化代谢主要依靠血液中葡萄糖供能，因此妊娠后期限饲会出现血液中葡萄糖降低的现象。任建林等[20]研究发现，饥饿状态下动物体自身会降低糖代谢水平，血液中葡萄糖含量会随之降低。总蛋白和尿素氮能够反映动物机体氮代谢的强弱[21]，总蛋白由白蛋白和球蛋白组成，白蛋白不仅能维持血浆渗透压，在动物体营养不足时还可以分解提供大量氨基酸，球蛋白主要有增强免疫的功效。BUN浓度与蛋白质摄入及利用相关，能够反映动物蛋白代谢活动[22]。不同日粮中含氮化合物降解速率、氨的合成速率及瘤胃微生物利用氨的速率直接影响BUN含量，是反应动物体氮代谢平衡的重要指标[23]。雷蕾等[24]、张志飞等[25]发现，牦牛血清中BUN的适宜含量为5.94~8.56 mmol/L。有研究显示，牛的血液中尿素氮浓度分别小于4 mmol/L时，会使血液中更多尿素氮进入瘤胃被消化吸收；当高于4 mmol/L时，尿素氮进入瘤胃过程中会受到抑制[26]。本试验中，牦牛血清中尿素氮的含量为1.89~2.50 mmol/L，处于较低状态，这会使尿素氮进入瘤胃，增加氨态氮浓度，这与本试验瘤胃发酵指标相符。血清中ALT和AST活性与氮代谢有关，两者均是动物机体重要的氨基酸转移酶，能够促进蛋白质的合成[27]，ALT和AST衡量肝脏健康状况的重要指标之一[28]。当细胞受损时，ALT和AST会释放到血液里，使血清转氨酶活性升高，但当ALT和AST活性在合理范围时，能够促进蛋白质的合成[29]。本试验中，IR60组牦牛ALT活性显著低于另外2组，IR80组的AST活性低于另外2组，这可能是牦牛的生理特性和限饲导致的。3.3饲喂水平对妊娠期牦牛血液生殖激素指标的影响妊娠过程中生殖激素发挥着极其重要的作用。E2在妊娠前期由母体卵巢合成，到妊娠中期，雌激素含量增加，会刺激母体组织增生，尤其是子宫和乳腺的发育，为胎儿的出生做准备[30]。P4在低含量时与雌激素协同引发发情行为，高含量时抑制发情[31]。母体妊娠期间，孕酮能够抑制子宫收缩，降低子宫肌层的兴奋活动，促进胎盘的发育，维持正常妊娠[32]。Ahmed等[33]的研究表明，整个妊娠组母牛P4含量无明显变化，这与本试验得到的结果相同。LH的主要作用是促进卵泡生长与成熟，并诱导排卵[34]。本试验中，IR60组5种生殖激素均受到抑制，施琼等[35]有关妊娠初期秦川母牛的试验表明，高蛋白饲喂组中试牛FSH、LH、E2和P4显著高于低蛋白组。康晓龙[36]研究表明，母羊血液FSH与日粮氮水平呈正相关。Polkowska等[37]研究表明，低氮营养日粮会显著降低生长期母羊血液中LH的含量，以上结果均与本试验结果相同，原因可能是因为大多生殖激素为蛋白质构成，氮代谢的产物又是很多受体蛋白的前体物质，氮含量的变化影响了下丘脑-垂体-卵巢激素分泌轴，因此母牛体内的FSH、E2、P4和LH的生成、存储及释放都发生改变。4结论在本试验条件下，妊娠后期限制饲喂影响妊娠期牦牛瘤胃的发酵和机体的健康，降低血清中葡萄糖和生殖激素的水平，不限饲是最适宜的饲喂模式。