金霉素（Chlortetracycline，CTC）是1种四环素类广谱抗生素，对革兰阴性菌、革兰阳性菌、立克次体和大型病毒均有明显抑制作用[1]。据推测，金霉素通过抑菌作用阻挡病原侵袭，从而保护动物尤其是新生动物远离疾病，并达到促进生长的作用[2]。但在养殖环节长期使用金霉素会增加致病菌产生耐药性风险。饲料中超量添加、养殖环节超范围使用及不遵守休药期等违规行为，造成畜产品中药物残留，对人类身体健康造成潜在的威胁[3]。准确检测饲料中金霉素含量，对保障畜禽产品质量安全具有重要意义。在测量操作过程中常存在由仪器设备、容量器具和人为操作所引入的可以评估的，对测量结果有着不确定影响的因素，特别是对于处在规定要求（指标）临界值周围的测量结果的判定。将测量不确定度与规定要求进行比较，可以得到基于测量的误判概率，从而控制风险[4]。因此，准确评估饲料中金霉素测定的不确定，对饲料质量安全监测工作中产品质量安全判定具有重要作用。本研究针对《GB/T 19684—2005饲料中金霉素的测定 高效液相色谱法》测定过程，查找影响不确定度的因素，分析各不确定度的分量，对结果进行不确定度评价，最终给出测量结果的置信区间和置信水平[5-15]。评价方法严格按照国标规定的测定操作步骤进行评定，充分考虑各个环节，为饲料质量安全监测工作中金霉素含量合格判定，提供可复制的测定结果不确定度评价方法，以提高判定结果可靠性和准确性。1材料与方法1.1试验材料标准品：盐酸金霉素标准品（纯度≥99.5%，德国Dr.E公司）。试剂：乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher公司）；草酸、盐酸、丙酮（分析纯，国药集团）；试验用水为一级水。样品：乳仔猪配合饲料。色谱柱：C18柱（柱长150 mm、内径4.6 mm、粒度5 μm，美国安捷伦科技公司）；0.45 μm水系滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）。仪器设备：安捷伦1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）、BT224s电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）、DELTA320 pH计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、飞鸽牌台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。1.2试验设计1.2.1试剂配制提取液配制比例按丙酮∶盐酸溶液（4 mol/L）∶水=13∶1∶6，使用盐酸调节pH值至1.0~1.2，混匀，备用。金霉素标准溶液：准确称取盐酸金霉素标准品13.53 mg（精确至0.01 mg）于50 mL棕色容量瓶中，使上述样品提取液溶解，定容，此溶液中金霉素含量为250 mg/L（金霉素与其盐酸盐质量分数换算系数为0.929），4 ℃保存一周内有效，使用前加水稀释至10 mg/L上机检测。1.2.2样品前处理选取有代表性的乳仔猪配合饲料250 g，按照GB/T 14699.1规定的四分法缩减至100 g，粉碎，通过0.45 mm孔径筛，充分混匀，备用。准确称取样品5 g（精确到0.000 1 g）置于具塞锥形瓶中，加入100 mL提取液混匀，摇床150 r/min振荡30 min。静置取上清液离心，5 000 r/min离心10 min（高浓度样品用水稀释后上机检测），过0.45 μm滤膜，上机测定。1.2.3仪器条件流动相∶草酸溶液[c（1/2H2C2O4）=0.01 mol/L]∶乙腈∶甲醇=75∶15∶10；流速为1 mL/min、检测器为紫外检测器、检测波长为375 nm、进样量为10 μL。1.2.4结果计算采用外标法单点定量，根据浓度与峰面积的关系计算样品中金霉素含量。X=C×Vm×n (1)式中：X为饲料中金霉素含量（mg/kg）；C为试样中金霉素浓度（mg/L）；V为样提取体积（mL）；m为样品质量（g）；n为稀释倍数。1.3不确定因素来源分析（见图1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.021.F001图1不确定度来源测定过程中，根据数学模型及操作环节分析高效液相色谱法测定饲料中金霉素含量的不确定度来源主要包括：定量计算引入的不确定度urel（w）（A类评定）、试样中金霉素浓度的不确定度urel（C）（B类评定）、试样提取体积的不确定度urel（V）（B类评定）、试样称样质量的不确定度urel（m）（B类评定）和稀释过程的不确定度（如进行此操作）urel（n）（A类评定）。2结果与分析2.1定量计算的不确定度urel（w）试验对样品重复测定3次，称样量分别为5.011 2、5.002 7和5.022 1 g，提取后样液浓度分别为3.477 1、3.502 2和3.455 7 mg/L，样品中金霉素含量为69.542、70.044和69.114 mg/kg，平均值为69.567 mg/kg。因测定方法采用外标法单点校正，因此计算过程引入的不确定度可忽略不计。2.2试样金霉素浓度的不确定度urel（C）C=P1P0×ρ (2)式中：C为试样金霉素浓度（mg/L）；P0为金霉素标准溶液峰面积；P1为试样溶液峰面积；ρ为金霉素标准溶液浓度（mg/L），金霉素浓度不确定度由上述各因素引入。2.2.1标准品浓度的不确定度urel（ρ）标准品纯度引入的不确定度u1rel（ρ）：盐酸金霉素标准品由德国Dr.E公司提供，纯度为99.5%，根据标准品证书中给出的不确定度为U（ρ）=±2.0%（k=2），视为矩形分布（k=3），由标准品纯度引入的相对标准不确定度为：u1rel(ρ)=U(ρ)k=2.03=0.011 55。标准品称量引入的不确定度u2rel（ρ）：称量标准品13.53 mg，天平检定证书显示最大允许误差（PEmax1）为±0.02 mg，换算成相对标准不确定度为：u2rel（ρ）=PEmax1k×m=0.02 mg3×13.53 mg=0.000 85。标准品定容引入的不确定度u3rel（ρ）：标准品配制用50 mL容量瓶溶解，定容。根据JJG 196—2006《常用玻璃量器》规定（所用玻璃量器允许误差及引入的不确定度见表1），20 ℃时，50 mL A级容量瓶的允许误差（PEmax2）±0.050 mL，按矩形分布计算（k=3），由容量瓶引入的不确定度为：u3rel（ρ）=PEmax2k×V=0.05 mL3×50 mL=0.000 58。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.021.T001表1玻璃量器的最大允许误差及不确定度玻璃量器最大允差/mL相对标准不确定度50 mL容量瓶±0.0500.000 581 mL单标线吸量管±0.0070.004 04100 mL量筒（量入式）±0.5000.002 89标液浓度由温度波动引入的不确定度u4rel（ρ）：实验室内温度不能保证绝对恒定，一般控制在（20±3）℃，金霉素标准溶液的溶剂为样品提取液（丙酮∶盐酸溶液（4 mol/L）∶水=13∶1∶6），20 ℃时各溶液的膨胀系数和区间半宽度（见表2），按B类评定，且服从均匀分布，包含因子k2（ρ）=3，在（20±3）℃时，试样提取液的膨胀系数为1.01×10-3。因此，相对标准不确定度为u4rel（ρ）= 3.03×10-33=0.001 75。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.021.T002表220 ℃时各溶液的膨胀系数和区间半宽度组别膨胀系数/℃-1区间半宽水2.08×10-46.24×10-4丙酮1.43×10-34.29×10-34 mol/L盐酸4.55×10-41.37×10-3试样提取液1.01×10-33.03×10-3标准品稀释引入的不确定度u5rel（ρ）：标准溶液稀释过程，利用1 mL单标线吸量管吸取标准贮备液到50 mL容量瓶中，加水稀释。按矩形分布计算（k=3），由1 mL单标线吸量管引入的不确定度为：u51rel（ρ）= PEmax3k×V=0.07 mL3×1.0 mL=0.004 04；由50 mL容量瓶引入的不确定度为：u550rel（ρ）=0.05 mL3×50 mL=0.000 58。合成标准品稀释过程中由容量器具引入的不确定度为：u5rel（ρ）=u51rel(ρ)2+u550rel(P)2=0.000 582+0.004 042=0.004 08。标准工作液稀释过程中，由温度波动（20±3）℃引起的水体积膨胀系数为2.08×10-4 ℃-1，其区间半宽度为：a（ρ）=3 ℃×2.08×10-4 ℃-1=6.24×10-4。按照B类评定，服从均匀分布，包含因子k5（ρ）=3，由水体积膨胀引入的相对标准不确定度为：u5rel(ρ)= a(ρ)k5(ρ)=6.24×10-43=0.000 36。合成标准品稀释引入的相对标准不确定度为u5rel(ρ)= u'5rel(ρ)2+u''5rel(ρ)2=0.004 082+0.000 362=0.004 10。因此，由标准物质纯度、称量、定容和稀释引起的不确定度合成标准物质浓度的相对不确定度计算如下：urel（ρ）=u1rel(ρ)2+u2rel(ρ)2+…+u2rel(ρ)5=0.011 552+0.000 852+…+0.004 102=0.012 42。2.2.2测定峰面积的不确定度urel（P）由北京市计量检定科学院给出的高效液相色谱仪的定量重复性0.1%，按照（n=6）的标准偏差计算，液相峰面积的不确定度为：urel（P）=0.1%/6 =0.000 41。此标准偏差随机测定，为A类不确定度。2.2.3合成试样金霉素浓度不确定度金霉素标准品浓度和高效液相色谱仪引起的不确定度合成试样中金霉素浓度相对标准不确定度为：urel（C）=urel(ρ)2+urel(P)2= 0.012 422+0.000 412=0.012 43。2.3样品称量的不确定度urel（m）准确称取样品5 g（精确至0.000 1g），称量过程引入的不确定因素主要来自电子天平的分辨率和校准结果。经北京市计量检定科学院给出的证书显示：最大允许误差为±0.5 mg。按照矩形分布（k=3），换算成不确定度为0.5 mg/3=0.288 68 mg。样品称量3次，分别为5.011 2、5.002 7和5.022 1 g，引起的相对不确定度为：urel（m1）=0.288 685.011 2×1 000=0.000 058；urel（m2)=0.288 685.002 7×1 000=0.000 058；urel（m3）=0.288 685.022 1×1 000=0.000 0057；则样品称量引入的相对标准不确定度：urel(m)=urel(m1)2+urel(m2)2+urel(m3)23=0.000 0582+0.000 0582+0.000 05723=0.000 058。2.4样品提取过程引入的不确定度urel（V）。此检测方法样品提取过程十分简单。主要的不确定度主要由提取液量取所引起的。本试验所用100 mL量入式量筒，经中国计量检定科学院检定合格，其最大允差为±0.5 mL，按照矩形分布（k=3）计算，不确定度为：u1rel（V）=0.5 mL/3/100 mL=0.002 89。同时考虑由于温度波动引起的样品提取液体积膨胀引入的相对不确定度为：u2rel(V)= 3.03×10-33=0.001 75。综合考虑上述因素，可知样品提取过程由体积因素引入的相对标准不确定度为：urel(V) =u1rell(V) 2+u2rel(V)2=0.002 892+0.001 752=0.003 38。2.5样品稀释引入的不确定度urel（n）本试验不涉及稀释过程，因此不计算本部分。2.6合成标准不确定度urel（X）及扩展不确定度的计算综上所述，高效液相色谱法测定饲料中金霉素含量的各不确定度分量见表3，将各分量进行合成得到合成标准不确定度为：urel(X)=urel(c)2+urel(m)2+urel(v)2=0.012 432+0.000 0582+0.003 382=0.012 8810.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.021.T003表3相对不确定度不确定度分量不确定度来源分布类型相对标准不确定度定量计算的不确定度urel（w）外标法单点计算，可忽略不计正态分布A—试样金霉素浓度的不确定度urel（C）标准品纯度矩形分布B0.011 55标准品称量矩形分布B0.000 85标准溶液配制的玻璃量器矩形分布B0.000 58标准贮备液稀释矩形分布B0.004 10样品提取液体积膨胀均匀分布B0.001 75温度波动水体积膨胀均匀分布B0.000 36高效液相测定重复性正态分布A0.000 41样品称量的不确定度urel（m）天平允差矩形分布B0.000 005 7样品提取的不确定度urel（V）提取液量取矩形分布B0.002 89样品稀释的不确定度urel（n）本次试验未涉及正态分布A—关于扩展不确定度的计算，多数测量采用包含因子k=2衡量，此时对应的置信概率为95%，因此饲料中金霉素含量的不确定度为：U=2×X×urel(X)=2×69.567×0.012 88=1.792 mg/kg。本试验饲料样品中，金霉素含量测定结果为（69.567±1.792） mg/kg，k=2。3讨论中华人民共和国农业农村部第194号公告的发布，标志着我国全面进入“饲料禁抗”时代，对饲料中金霉素的监管越来越重要。饲料中金霉素的准确测定始终是饲料质量安全监测工作的重点和难点。通过评定可知：此测定过程中不确定度的主要源自标准溶液的配制、高效液相色谱仪的上机测定、样品的称量和提取过程。其中标准品纯度及标准溶液配置过程引入的不确定度成为影响检测结果最重要的因素，通过评定可知样品称量对结果的干扰最小。因此在日常检测中，为保证检测结果准确性，要严格规范操作、定期检定所用玻璃器皿和仪器设备、增加样品重复性、并对标准物质进行期间核查，以保证测量结果的准确性。4结论本研究评定国家标准规定的高效液相色谱法测定饲料中金霉素的不确定度，结果显示，标准品浓度是最大的不确定度分量，相对标准不确定度为0.012 42；样品提取过程中体积因素引入的相对标准不确定度为0.002 89；样品称量对结果影响的最小。该乳仔猪饲料中金霉素含量为X=（69.567±1.792）mg/kg，k=2。