地顶孢霉培养物是指从古尼虫草中分离提取的真菌——地顶孢霉，经过人工发酵制备而成的1种虫草源真菌饲料添加剂。地顶孢霉培养物中含有虫草素、虫草酸、虫草多糖等，具有与古尼虫草相似的活性成分和生物学功能，但是地顶孢霉培养物的价格远低于天然虫草。因此，地顶孢霉培养物在动物生产中具有巨大的应用价值。在饲料中添加地顶孢霉培养物能够提高肉鸡的平均日增重，增强肉鸡血清抗氧化能力，提高肉鸡免疫脏器指数和血清IgG、sIgA浓度[1]。地顶孢霉培养物能够降低断奶仔猪腹泻率，改善断奶仔猪肠道健康，提高断奶仔猪免疫抗体滴度，增强断奶仔猪的体液免疫应答功能[2]。研究表明，地顶孢霉培养物能够提高断奶犊牛的生长性能，增强断奶犊牛抗氧化和免疫功能[3]；提高奶牛产奶量，降低牛乳中体细胞数[4]；具有改善黑豚的生长性能、屠宰性能和免疫器官指数等作用[5]。但是，对地顶孢霉培养物的研究局限在动物生产性能、抗氧化能力和免疫脏器指数或抗体免疫效价等单一的免疫指标评价上，缺少对动物整体免疫功能的研究。因此，本试验以小鼠为试验对象，研究地顶孢霉培养物对动物免疫功能的影响，为地顶孢霉培养物在实际生产应用中提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验原料地顶孢霉培养物购自浙江汇能生物股份有限公司。地顶孢霉培养物由古尼虫草无性型真菌—地顶孢霉菌经液体深层发酵制备而成，含量：地顶孢霉培养物（以腺苷计）≥1 mg/g，批号：319083001。临用前在无菌条件下使用生理盐水配制所需浓度，现配现用。1.1.2试验动物与饲养选用48只体重18~22 g的雄性SPF级BALB/c小鼠和120只体重18~22 g的雄性SPF级ICR小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）。小鼠自由采食、饮水，12 h光照、（22±1）℃、湿度50%~70%。1.1.3仪器与试剂721型分光光度计购自上海佑科仪器仪表有限公司；酶标仪购自美国Bio-RAD公司；电子分析天平购自瑞士Mettler Toledo公司。脂多糖（LPS）、刀豆素（ConA）、噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司；RPMI1640培养液购自美国Hyclone公司；K562细胞购自上海通派生物科技有限公司；二甲基亚砜、乳酸锂、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）购自国药集团化学试剂有限公司；印度墨汁购自北京雷根生物技术有限公司；脱纤维绵羊血（SRBC）购自上海通蔚生物科技有限公司；SA缓冲液、Hank's液、Tris-HCl缓冲液、NP40细胞裂解液、氧化型辅酶Ⅰ（NAD）购自北京索来宝科技有限公司；都氏试剂（血红蛋白氧化剂）购自焦作云之羽生物科技有限公司；豚鼠血清购自南京森贝伽生物科技有限公司。1.2试验方法1.2.1试验分组分组1：雄性BALB/c小鼠随机分为低、中、高3个剂量组和正常对照组，每组各12只，分别给予0.5、1.0、2.0 g/kg的BW地顶孢霉培养物和20 mL/kg的BW生理盐水。经口灌胃，0.2 mL/10 g，1次/d，连续30 d。测定小鼠免疫脏器指数、淋巴细胞增殖能力和NK细胞活性。分组2：雄性ICR小鼠随机分为低、中、高3个剂量组、模型对照组和正常对照组，每组各12只。剂量组分别给予0.5、1.0、2.0 g/kg的BW地顶孢霉培养物，模型对照组和正常对照组给予20 mL/kg的BW的生理盐水。1次/d，连续30 d。用于小鼠溶血素抗体生成试验和碳粒廓清试验，两个试验分别进行。1.2.2免疫脏器指数测定小鼠经口给药30 d，处死，取脾脏和胸腺，称重，计算脏器指数。脏器指数=脏器重量/体重×100%(1)1.2.3小鼠脾淋巴细胞增殖试验（MTT法）小鼠给药结束，处死，无菌取脾脏，制备浓度为（5~10）×106 个/mL的脾细胞悬液。将细胞悬液加入96孔板，每孔200 μL，重复4孔，设立空白对照孔，其余孔加入100 μL的ConA 2.5 mg/L或LPS 5.0 mg/L，37 ℃、5%CO2培养箱中培养72 h，加入10 μL的MTT，培养4 h，弃上清液，加入150 μL的二甲基亚砜，充分振荡，测定OD570 nm。淋巴细胞转化刺激指数(SI值)=加ConA或LPS细胞孔的平均OD值/对照孔的平均OD值(2)1.2.4NK细胞活性检测将上述1.2.3小鼠脾细胞作为效应细胞，调整细胞浓度为1×107个/mL；另取生长良好的K562细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL；各取100 μL脾细胞和K562细胞（效靶比100∶1）加入96孔板中，设靶细胞自然释放对照组（100 μL靶细胞+100 μL培养液）和最大释放对照组（100 μL靶细胞+100 μL 1%NP40），每组3个重复孔；37 ℃、5%CO2培养箱培养4 h，1 500 r/min离心5 min，每孔取100 μL上清置于96孔培养板中，加入100 μL乳酸脱氢酶（LDH）基质液，反应3 min，每孔加入30 μL 1 mol/L的HCl，酶标仪检测OD490 nm，计算NK细胞活性。NK细胞活性=[ODT-(ODS-ODE)]/ODT×100%(3)式中：ODT为靶细胞空白光密度值；ODS为样品光密度值；ODE为效应细胞空白光密度值。1.2.5SRBC致小鼠溶血素抗体生成试验试验小鼠按1.2.1的组2进行分组和给药。给药结束，除正常对照组外，其余4组小鼠腹腔注射0.2 mL 20%（体积比）SRBC的进行免疫；4 d，颌下静脉取血，收集血清，使用SA缓冲液稀释500倍；取1 mL稀释后的血清置于试管中，依次加入0.5 mL 10%（体积比）SRBC、1 mL补体（使用SA液按1∶8稀释），混匀；设SA液代替血清的空白对照管；37 ℃水浴15 min，将试管移入冰浴终止反应。2 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加3 mL都氏试剂，充分混匀，10 min后于540 nm测定吸光度；取0.25 mL 10%（体积比）SRBC用都氏试剂加至4 mL，混匀，10 min后测定OD540 nm作为半数溶血对照，计算样品管半数溶血值HC50。HC50=(样品的吸光度值/SRBC半数溶血时的吸光度值)×稀释倍数(4)1.2.6小鼠体内碳粒廓清试验试验小鼠按1.2.1的组2进行分组和给药。末次给药24 h，称重，除正常对照组外，其余4组小鼠尾静脉注射0.1 mL/10 g四倍稀释的印度墨汁；分别在2、10 min从眼内眦静脉丛取血10 μL，加到1 mL 0.1%的Na2CO3溶液中。以Na2CO3溶液作空白对照，用分光光度计测定OD600 nm值。小鼠处死，取肝脏和脾脏，称重。利用吸光度值和脏器重量计算吞噬指数。吞噬指数=体重/(肝重+脾重)×K1/3 (5)式中：K=（logOD2 min-logOD10 min）/8。1.3数据统计与分析数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示，采用t检验评价试验结果，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1地顶孢霉培养物对小鼠免疫脏器指数的影响（见表1）由表1可知，给予地顶孢霉培养物后，低剂量组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均极显著高于对照组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.018.T001表1地顶孢霉培养物对小鼠免疫脏器指数的影响组别胸腺指数脾脏指数正常对照组1.029±0.1104.157±0.119低剂量组1.248±0.175**4.473±0.198**中剂量组1.077±0.0954.203±0.301高剂量组1.155±0.1104.245±0.132注：同列数据肩标*表示差异显著（P0.05），**表示差异极显著（P0.01）；表2与此同。%2.2地顶孢霉培养物对小鼠脾淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响（见表2）由表2可知，与正常对照组相比，试验组的T、B淋巴细胞刺激指数均有不同程度的升高；中剂量组的T淋巴细胞SI值极显著高于正常对照组（P0.01），中剂量组的B淋巴细胞SI值显著高于正常对照组（P0.05）。高剂量组的B淋巴细胞SI值极显著高于正常对照组（P0.01）。试验组小鼠的NK细胞活性较正常对照组均呈上升趋势；低剂量组的NK细胞活性极显著高于正常对照组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.018.T002表2地顶孢霉培养物对小鼠脾淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响组别T淋巴细胞SI值B淋巴细胞SI值NK细胞活性/%正常对照组1.917±0.3031.666±0.2467.874±1.918低剂量组1.934±0.3581.655±0.25513.823±4.143**中剂量组2.349±0.312**1.888±0.221*11.180±3.600高剂量组2.068±0.4132.131±0.289**10.343±3.8512.3地顶孢霉培养物对SRBC致小鼠溶血素抗体生成的影响（见表3）由表3可知，经SRBC免疫的4组小鼠的半数溶血值均极显著高于未免疫的正常对照组（P0.01）。与模型组（SRBC免疫未给药）相比，高剂量组小鼠的半数溶血值极显著升高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.018.T003表3地顶孢霉培养物对SRBC致小鼠溶血素抗体生成影响组别半数溶血值（HC50）正常对照组6.70±2.48模型对照组202.27±4.37**低剂量组200.73±4.67**中剂量组202.05±3.11**高剂量组208.98±3.34**ΔΔ注：与正常对照组比较，*表示差异显著（P0.05），**表示差异极显著（P0.01）；与模型对照组比较，Δ表示差异显著（P0.05），ΔΔ表示差异极显著（P0.01）；表4与此同。2.4地顶孢霉培养物对小鼠体内碳粒廓清功能的影响（见表4）由表4可知，静脉注射印度墨汁的4组小鼠巨噬细胞吞噬指数极显著高于正常对照组（P0.01）。与模型组（仅注射墨汁未给药）相比，给予地顶孢霉培养物后，各组小鼠的巨噬细胞吞噬指数均有不同程度的升高，低、中剂量组的细胞吞噬指数显著高于模型对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.018.T004表4地顶孢霉培养物对小鼠体内碳粒廓清功能的影响组别吞噬指数正常对照组2.393±0.291模型对照组4.606±0.087**低剂量组5.214±0.448**Δ中剂量组5.198±0.745**Δ高剂量组4.741±0.483**3讨论3.1地顶孢霉培养物对小鼠免疫脏器指数的影响胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，能够产生T淋巴细胞、B淋巴细胞，参与机体的免疫应答反应。胸腺产生T淋巴细胞，主要参与细胞免疫；脾脏以B淋巴细胞占多数，与体液免疫关系密切。因此，胸腺指数和脾脏指数常作为判断机体细胞免疫和体液免疫功能强弱的初步观察指标[6]。本试验结果表明，地顶孢霉培养物能够提高小鼠免疫脏器指数。李洋等[7]研究地顶孢霉培养物对SD大鼠脏器指数的影响，结果表明，地顶孢霉培养物能够显著提高肝脏指数和胸腺指数。马淑梅等[8]研究蛹虫草对免疫抑制小鼠脏器指数的影响，研究表明，蛹虫草能够明显拮抗地塞米松造成的胸腺指数和脾脏指数下降。本试验中，小鼠经口灌胃不同剂量的地顶孢霉培养物后，胸腺指数和脾脏指数均升高，但与剂量无相关性，提高幅度以低剂量组最显著（P0.01）。本试验结果与刘春泉等[9]研究结果相似，即低剂量虫草组在提高小鼠胸腺指数和脾脏指数方面优于高剂量组。3.2地顶孢霉培养物对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段，因此，检测淋巴细胞增殖水平是评价免疫功能的重要指标之一。参与机体免疫应答的免疫效应细胞以T、B淋巴细胞为主，因此，常用T、B淋巴细胞的体外增殖转化能力来评价机体的免疫功能[10]。T、B淋巴细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可以使相应淋巴细胞发生增殖，参与机体免疫应答过程，ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，而LPS可以诱导B淋巴细胞增殖[11]。陶根金等[12]通过构建免疫抑制小鼠模型对发酵虫草菌粉的免疫调节作用进行研究，研究表明，分别以100和200 mg/kg剂量的虫草菌粉连续灌胃小鼠7 d，均能够显著提高小鼠脾脏T、B淋巴细胞的增殖。研究表明，虫草多糖可以克服环磷酰胺诱导的小鼠免疫抑制，增强脾淋巴细胞活性[13]；能够刺激鸡外周血淋巴细胞增殖，提高鸡新城疫血清抗体滴度和血清γ-干扰素（γ-IFN）和白细胞介素-4（IL-4）浓度[14]。与试验中地顶孢霉培养物在提高小鼠脾淋巴细胞增殖能力方面结果一致。B淋巴细胞在抗原刺激下可以分化为浆细胞，浆细胞可以合成和分泌抗体，主要执行机体的体液免疫。本试验中，高剂量的地顶孢霉培养物对T、B两种淋巴细胞的增殖能力表现出一定的差异，对B淋巴细胞表现出极显著增加（P0.01），但对T淋巴细胞无明显变化（P0.05）。因此，高剂量的地顶孢霉培养物在增强小鼠体液免疫功能方面表现更优。3.3地顶孢霉培养物对小鼠NK细胞活性的影响NK细胞能够直接杀伤靶细胞，而且对T/B淋巴细胞具有调节作用。研究发现，增强NK细胞活性对机体免疫调节具有重要的意义[15]。滕伟卓[16]研究发现，3.0 g/kg蝙蝠蛾拟青霉菌粉能够显著提高NK细胞杀伤活性，杀伤活性与阳性对照组相当。赵宏宇等[17]在研究蛹虫草对小鼠NK细胞活性的影响时，也获得了相似的结论。本试验结果显示，地顶孢霉培养物能够提高小鼠NK细胞活性，其中低剂量组效果最佳。3.4地顶孢霉培养物对SRBC致小鼠溶血素抗体生成影响绵羊红细胞可以使淋巴细胞产生特异性抗SRBC抗体，并释放至外周血，分离出致敏动物的血清，与绵羊红细胞一起孵育，在补体参与下，可以产生溶血现象。致敏动物血清中溶血素的含量可以通过溶血过程中释放血红蛋白量来测出，反映药物对体液免疫功能的影响[18]。张洁宏等[19]研究蝙蝠蛾拟青霉菌丝体对小鼠血清溶血素和抗体生成细胞的影响，结果表明，与阴性对照组相比，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体能够显著提高小鼠的抗体生成细胞数和小鼠血清溶血素。本试验结果显示，地顶孢霉培养物试验组的血清溶血素均高于模型组（SRBC免疫未给药），其中高剂量组上升明显，表明地顶孢霉培养物能够增强小鼠特异性体液免疫功能。3.5地顶孢霉培养物对小鼠体内碳粒廓清功能的影响巨噬细胞具有强大而迅速吞噬清除异体颗粒或某些可溶性异物的能力，能够迅速清除体内自身产生的某些有害物质，巨噬细胞吞噬作用的强弱是衡量其活性的重要指标[20]。赵萍等[21]研究显示，蝙蝠蛾被毛孢菌丝体发酵液能够显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力。罗建光[22]研究发现，在50~2 000 μg/mL的剂量范围内，虫草液体发酵水提物能够提高巨噬细胞吞噬能力，促进小鼠脾细胞增殖。本试验中，0.5~1.0 g/kg BW的地顶孢霉培养物能够显著提高小鼠巨噬细胞吞噬能力，且与模型组（仅注射墨汁未给药）出现显著差异。因此，地顶孢霉培养物能够增强小鼠非特异性免疫功能。地顶孢霉中与古尼虫草相似的生物活性物质，如虫草素（3-脱氧腺苷）、虫草酸（D-甘露醇）、植物甾醇、多糖类物质等，已被证实具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等药理作用[23-25]。本试验研究中，地顶孢霉培养物能够有效调节小鼠免疫功能，对特异性和非特异性免疫功能均有一定的作用，与前人研究一致[7,17,19]。但是，地顶孢霉培养物在增强小鼠免疫功能方面与剂量不呈相关性，不同的给药剂量在增强小鼠特异性免疫和非特性免疫方面表现不一。本试验中，高剂量地顶孢霉培养物能够显著提高B淋巴细胞增殖能力和小鼠溶血素抗体，在提高机体特异性免疫应答能力和特异性抗体分泌水平方面表现更优；而中低剂量组能够显著提高NK细胞活性和巨噬细胞吞噬能力，在增强非特异性免疫方面效果更优。因此，地顶孢霉培养物以低剂量长期添加时能够有效增强机体非特异性免疫功能，提高抗病能力，且地顶孢霉培养物在高剂量添加时能够增强机体对抗原的免疫应答能力，提高抗体滴度，增强疫苗免疫效果。4结论地顶孢霉培养物能够在一定程度上增强小鼠的特异性免疫和非特异性免疫功能，提高小鼠免疫脏器指数，增强淋巴细胞增殖反应，提高NK细胞活性，促进小鼠溶血素抗体的产生，增强巨噬细胞吞噬能力。高剂量（2.0 g/kg BW）地顶孢霉培养物在增强小鼠特异性体液免疫性能方面表现更优，而中（1.0 g/kg BW）、低（0.5 g/kg BW）剂量的地顶孢霉培养物在增强小鼠非特异性免疫功能方面效果更佳。