益生菌能够调节、维持肠道内菌群平衡，具有抑制病原菌、提高机体免疫力等[1]功能；与抗生素相比，益生菌具有抗菌活性，却无抗生素的副作用，是抗生素重要替代品之一[2-3]。凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，发酵产生L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。凝结芽孢杆菌除具有乳酸菌的优点，还同时具有芽孢杆菌的抗逆性、耐贮存与耐高温等优点[4]，且能通过自身所产生的细菌素抑制病原菌、刺激抗体分泌，增强免疫系统抵抗力，从而改善肠道健康[5]。本研究的凝结芽孢杆菌ZC-1为猪肠道内分离获得，并且通过16S rRNA基因测序及生理生化试验确定。通过对凝结芽孢杆菌ZC-1的部分特性进行试验研究，旨在为后续该菌株相关产品开发、生产及应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品来源凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）ZC-1由本实验室分离自健康猪肠道，保存于-80 ℃冰箱。抑菌试验指示菌株：大肠杆菌CMCC44103（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌CMCC26003（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌CMCC50094（Salmonella）、藤黄微球菌CMCC28001（Micrococcus luteus）、产气荚膜梭菌ATCC13124（Clostridium perfringens）、肺炎克雷伯菌CMCC46117（Klebsiella pneumoniae）、白色念珠菌GIM2.194（Candida albicans）、痢疾志贺氏菌GIM1.236（Shigella castellani）、普通变形杆菌GIM1.703（Proteus），均购自广东省微生物菌种保藏中心，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）由本实验室分离纯化。1.1.2培养基与试剂凝结芽孢杆菌液体MRS培养基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏5.0 g/L、酵母浸膏4.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、醋酸钠5.0 g/L、柠檬酸三铵2.0 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、水1 000 mL（pH值6.2）。10种药敏纸片（杭州滨和微生物试剂有限公司）、胃蛋白酶（猪源，生产批号：20210415，国药集团化学试剂有限公司）、猪胆盐（生产批号：20210325，上海沃凯化学试剂有限公司）。1.1.3试验动物28日龄BALB/c小鼠，购自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司。1.2试验方法1.2.1菌株活化将凝结芽孢杆菌ZC-1冻存管从-80 ℃低温冰箱取出，接种于液体培养基，装液量100 mL/500 mL，37 ℃、180 r/min培养18 h。1.2.2菌株最适生长温度测定以活化后的凝结杆菌ZC-1培养液按2%接种量接入装液量100 mL/500 mL的液体培养基，分别在温度30、35、40、45与50 ℃的恒温摇床中180 r/min培养24 h，每隔4 h取样检测菌液OD600 nm值。1.2.3菌株抑菌试验凝结芽孢杆菌ZC-1于液体培养基培养24 h，10 000 r/min离心10 min，取上清，4 ℃冰箱备用；菌体使用无菌生理盐水清洗离心，重复2次，使用无菌生理盐水重悬并调节菌浓约108 CFU/mL，4 ℃冰箱备用。取1 mL指示菌菌悬液加入50 ℃、100 mL MRS琼脂培养基中摇匀（菌终浓为106 CFU/mL），倒入培养皿中（厚度约为3 mm），待冷却凝固后将牛津杯置于平板中，往牛津杯中加入0.20 mL上清液或菌悬液，置于37 ℃培养24 h，观察有无抑菌圈产生，并用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。1.2.4菌株药敏试验采用双层平板，底层为10 mL MRS琼脂培养基，凝固后加入5 mL含活菌数约为106 CFU/mL的凝结芽孢杆菌ZC-1的MRS琼脂培养基，冷却凝固后贴上药敏纸片，放置冰箱静置1 h，将平皿置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察并测量抑菌圈直径大小。1.2.5菌株耐受胃酸、胆盐及高温试验配置人工胃酸[6]，调节1 mol/L盐酸pH值分别至2.0、2.5与3.0。凝结芽孢杆菌ZC-1活化后的培养液离心收集菌体，并采用无菌水稀释至活菌数约108 CFU/mL，按1%接种量加入不同pH值的人工胃液中，分别在37 ℃水浴恒温处理0、1、2、4与6 h后活菌计数，37 ℃培养24 h，计算菌存活率。将凝结芽孢杆菌ZC-1活化后的培养液离心，取菌沉淀稀释至活菌数约108 CFU/mL，分别按1%接种量分别加入0.3%、0.5%与0.7%质量浓度的猪胆盐溶液中，分别37 ℃水浴恒温处理0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h后活菌计数，37 ℃培养24 h计算菌存活率。凝结芽孢杆菌ZC-1活化后的培养液放置80、90、100 ℃水浴保温5、10、20、30 min，计算菌存活率。1.2.6菌株安全性试验溶血试验：将凝结芽孢杆菌ZC-1液体培养基培养24 h，采用无菌生理盐水10倍递增稀释至10-5，吸取0.1 mL稀释菌液至含5%兔血的MRS琼脂平板，涂布均匀。37 ℃恒温培养48 h，观察有无溶血圈。小鼠毒性试验：以凝结芽孢杆菌ZC-1液体培养基，培养24 h，4 ℃冰箱备用。选取15只健康小鼠，其中5只为对照组，饮洁净水；另10只为试验组，每天饮水添加凝结芽孢杆菌ZC-1培养液，使饮水中菌浓度约为108 CFU/mL，连续10 d，每天记录小鼠生长情况及10 d后小鼠内脏器官是否出现病变情况。1.3数据统计与分析数据采用Microsoft Excel和SPSS软件进行统计分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行显著性检验，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同温度对凝结芽孢杆菌ZC-1生长情况的影响（见图1）由图1可知，凝结芽孢杆菌ZC-1在30~50 ℃均能生长。当发酵温度为40~45 ℃时，0~4 h为生长迟缓期，4~16 h为对数生长期，16 h后进入稳定期；而当发酵温度为30~35 ℃以及50 ℃时，生长迟缓期推迟至8 h，8 h后才进入对数生长期，此时的OD值与发酵温度在40~45 ℃间呈现极显著差异（P0.01），说明凝结芽孢杆菌ZC-1的最适发酵温度为40~45 ℃，尤其40 ℃最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.017.F001图1不同温度对凝结芽孢杆菌ZC-1生长情况的影响2.2凝结芽孢杆菌ZC-1及培养上清液对10株指示菌的抑菌效果（见表1）由表1可知，凝结芽孢杆菌ZC-1菌体对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等10株病原菌主要表现中敏感，而发酵上清液对10株病原菌主要表现出高敏感，表明发酵上清液对这10株病原菌的抑制效果优于凝结芽孢杆菌ZC-1菌体，进而表明凝结芽孢杆菌是通过某些代谢产物来抑制病原菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.017.T001表1凝结芽孢杆菌ZC-1及培养上清液对10株指示菌的抑菌效果指示菌凝结芽孢杆菌ZC-1发酵上清液抑菌圈/mm敏感性抑菌圈/mm敏感性大肠杆菌金黄色葡萄球菌沙门氏菌藤黄微球菌产气荚膜梭菌肺炎克雷伯菌白色念珠菌痢疾志贺氏菌普通变形杆菌铜绿假单胞菌11.26±0.0912.81±0.1812.05±0.1313.37±0.1617.80±0.1012.67±0.1408.64±0.2114.18±0.1813.14±0.2013.45±0.15中敏感中敏感中敏感中敏感高敏感中敏感低敏感中敏感中敏感中敏感16.34±0.1218.85±0.1517.37±0.1118.41±0.2524.37±0.0821.54±0.1211.57±0.1820.42±0.1718.86±0.1120.47±0.08高敏感高敏感高敏感高敏感极敏感极敏感中敏感极敏感高敏感极敏感注：不敏感0，低敏感10 mm，中敏感10~14 mm，高敏感15~20 mm，极敏感20mm[7]。2.3凝结芽孢杆菌ZC-1对10种药敏纸片的敏感性（见表2）由表2可知，凝结芽孢杆菌ZC-1对青霉素G、氯霉素、氨苄西林等9种药物表现出敏感，而只对呋喃唑酮表现出耐药性，表明凝结芽孢杆菌ZC-1对多种抗生素无耐药性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.017.T002表2凝结芽孢杆菌ZC-1对10种药敏纸片的敏感性抗生素纸片含量/(μg/片)抑菌圈直径解释标准/mm凝结芽孢杆菌ZC-1/mm耐药(R)中介(I)敏感(S)青霉素G10.00≤14—≥1527.5（S）氯霉素30.00≤1213~17≥1827.0（S）氨苄西林100.00≤1920~22≥2324.0（S）庆大霉素10.00≤1213~14≥1521.5（S）四环素30.00≤1819~22≥2332.5（S）呋喃唑酮300.00≤1415~16≥1713.0（R）链霉素10.00≤1112~14≥1520.5（S）红霉素15.00≤1516~20≥2129.0（S）复方新诺明1.25/23.75≤1011~15≥1624.5（S）诺氟沙星10.00≤1213~16≥1718.3（S）2.4凝结芽孢杆菌ZC-1耐受胃酸、胆盐及高温试验2.4.1不同pH值胃酸处理对凝结芽孢杆菌ZC-1耐受性的影响（见表3）由表3可知，pH值2.0处理1 h存活率为90.82%，处理2 h存活率85.41%，且4~6 h存活率较为稳定；pH值2.5处理1 h后存活率为92.25%，处理2 h存活率88.72%，且2~6 h存活率变化不大；pH值3.0处理1 h后存活率为94.67%，处理2 h存活率92.43%，且2~6 h存活率变化不大。凝结芽孢杆菌ZC-1随着pH值降低及处理时间延长，存活率下降，尤其pH值2.0时下降的较为明显。结果表明，凝结芽孢杆菌ZC-1能够耐受胃酸值在2.0~3.0，6 h存活率能够保持在73%以上，表明凝结芽孢杆菌ZC-1具有较好的耐酸能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.017.T003表3不同pH值胃酸处理对凝结芽孢杆菌ZC-1耐受性的影响处理不同处理时间存活率1 h2 h4 h6 hpH值2.090.8285.4176.4673.75pH值2.592.2588.7285.6885.18pH值3.094.6792.4391.7591.18%2.4.2不同浓度胆盐处理对凝结芽孢杆菌ZC-1耐受性的影响（见表4）由表4可知，凝结芽孢杆菌ZC-1在0.3%猪胆盐处理6 h，各个时间段中存活率变化不大，当猪胆盐浓度提升至0.7%，处理6 h，存活率为91.07%，与在0.3%猪胆盐相比，存活率下降5.2%，且随着猪胆盐浓度及处理时间的提高，凝结芽孢杆菌ZC-1存活率出现小幅度下降。结果表明，凝结芽孢杆菌ZC-1在6 h内能够耐受0.3%~0.7%猪胆盐浓度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.017.T004表4不同浓度胆盐处理对凝结芽孢杆菌ZC-1耐受性的影响处理不同处理时间存活率1 h2 h4 h6 h胆盐浓度0.3%98.4698.0597.1596.27胆盐浓度0.5%97.6895.6495.0994.85胆盐浓度0.7%95.7592.2891.8891.07%2.4.3不同温度处理对凝结芽孢杆菌ZC-1耐受性的影响（见表5）由表5可知，凝结芽孢杆菌ZC-1在80 ℃处理10 min，存活率为90.75%，且10~30 min内其存活率变化不大，说明在处理10 min时，未形成芽孢的菌体因高温死亡，而存活下来的多为以芽孢形式为主。100 ℃处理30 min，存活率为41.67%，说明凝结芽孢杆菌ZC-1具有较好的耐受高温的能力。当处理温度升高时，凝结芽孢杆菌ZC-1的存活率随着温度的升高、处理时间的延长，而有所下降，呈负相关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.017.T005表5不同温度处理对凝结芽孢杆菌ZC-1耐受性的影响处理不同处理时间存活率5 min10 min20 min30 min80 ℃95.6590.7590.4789.0790 ℃93.5890.6486.1584.82100 ℃82.1866.8658.1441.67%2.5菌株安全性试验在溶血试验中，凝结芽孢杆菌ZC-1涂布培养5%兔血琼脂平板，观察无溶血环形成。再将发酵液添加到小鼠日常饮水中（菌浓约108 CFU/mL），连续喂养10 d，对照组与试验组小鼠均无死亡，无异常表现。剖检观察未见任何器官、消化道出现病变，表明凝结芽孢杆菌ZC-1对小鼠安全、无毒副作用。3讨论3.1菌株最适生长温度及抑菌试验国内外多位学者以凝结芽孢杆菌为研究对象，通过优化培养条件，最终得出其最佳培养温度分别为60[8]、47[9]、45[10]、42[11]与37 ℃[12]，表明不同来源的凝结芽孢杆菌菌株，其最适生长温度略有差异。本研究的结果表明，凝结芽孢杆菌ZC-1最适发酵温度为40 ℃，与侯佳佳等[13]、孙标等[14]、于佳民等[15]的研究较为一致。但本研究以液体MRS作为发酵培养基，不同培养基是否会影响、甚至改变菌株的最适生长温度则有待后续研究。有研究表明，凝结芽孢杆菌通过产生凝固素（coagulin）、乳孢菌素（lactosporin）及乳酸来抑制病原菌[16-17]。Riazi等[18]研究结果显示，lactosporin对藤黄微球菌具有良好的杀灭效果。房一粟等[19]、姚晓红等[20]研究表明，凝结芽孢杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌及变形杆菌等病原菌有一定的抑制作用，与本研究中凝结芽孢杆菌ZC-1的结果较为一致。本研究中结果表明，离心发酵液的抑菌效果优于凝结芽孢杆菌ZC-1菌体，说明发酵液中含有抑菌成分，可以直接对病原菌进行抑制，菌体则需重新代谢产生，所以在抑菌时间上不占优势，故菌体的抑菌圈小于发酵液。而研究中采用液体MRS培养基发酵培养24 h，pH值为3.95，发酵液的抑菌效果究竟是由乳酸或是其他抗菌成分所产生的，则需后续进行验证研究。3.2菌株药敏试验有研究表明，细菌的耐药性可以通过微生物菌群的基因互相传递[21-22]，因此菌株安全性问题颇受关注。在2019实施的水产动物饲用乳酸菌与芽孢杆菌筛选标准中，对菌株安全性明确规定，所筛菌株无抗生素耐药性，所以对凝结芽孢杆菌ZC-1进行耐药性测试显得极其重要。郭志鹏等[4]研究表明，凝结芽孢杆菌N1对庆大霉素、氯霉素、青霉素等敏感，但对复方新诺明、诺氟沙星具有耐受性。金迅等[23]研究的凝结芽孢杆菌13002对青霉素、链霉素、四环素具有不同程度的耐药性。吴丹阳[24]研究结果显示，凝结芽孢杆菌T242对阿莫西林、四环素、氯霉素、利福平等敏感，对环丙沙星和红霉素为中介。多数研究结果会有一定差别，说明不同来源的凝结芽孢杆菌其对药物的耐受性会有差异。而本研究中，凝结芽孢杆菌ZC-1对青霉素G、氯霉素、氨苄西林、庆大霉素与四环素等9种药物表现敏感，只有呋喃唑酮对凝结芽孢杆菌ZC-1的抑制作用较弱，这可能与经常使用该药物导致产生耐药性有关。3.3菌株抗逆性试验菌株经胃到肠道内，其对胃酸、胆汁的耐受能力，可作为评价菌株能否在肠道内存活并发挥有益作用的重要指标之一[25]。通常胃酸pH值在2.5~3.5，空腹时达1.5，不同类型食物在胃中停留时间不一，一般在1~6 h范围，关于菌株的胆盐耐受试验，推荐浓度为0.15%~0.30%[26]。至于菌株对温度的耐受能力，可作为评价菌株抗逆性及能否加工制粒的一个重要指标。凝结芽孢杆菌所产生的芽孢，能够耐受胃酸、胆汁从而进入肠道[27]，其芽孢一般在人体4~6 h即可萌发，一般只有85%芽孢能够顺利通过消化系统进入肠道[28]，但约4~7 h肠道内的菌会通过排便而流失[29]。金迅等[23]研究表明，凝结芽孢杆菌13002于80 ℃条件作用10 min存活率达72.3%，0.3%胆盐作用4 h存活率达83.7%，pH值2.0条件下作用4 h存活率达40.0%。徐贤[11]研究表明，凝结芽孢杆菌C8经80 ℃条件作用30 min，存活率达10%，在模拟耐胃液和胆盐的试验表明，模拟胃液pH值2.0条件下作用2 h存活率20.9%，在0.3%胆盐处理24 h存活率为21.8%。张韵等[30]研究结果显示，凝结芽孢杆菌BC147在pH值1~2条件下处理2 h，存活率在15%以上；在pH值3.0条件下处理2 h，存活率为78.0%；在0.3%胆盐处理2 h，存活率在40%以上；0.5%胆盐处理2 h，存活率为45.3%。本研究中，凝结芽孢杆菌ZC-1在相同的处理条件下存活率均高于凝结芽孢杆菌13002、凝结芽孢杆菌C8与凝结芽孢杆菌BC147，可能因为本研究所用的凝结芽孢杆菌ZC-1芽孢率较高。王金果等[31]研究表明，凝结芽孢杆菌N001经100 ℃条件作用10 min，存活率为96.4%，高于本研究存活率66.86%的结果，但其在模拟胃液pH值2.0条件下作用6 h存活率为48.2%，低于本研究的73.75%。表明凝结芽孢杆菌N001所产生的芽孢能耐高温，但对酸耐受能力差，而本研究的凝结芽孢杆菌ZC-1不管是对温度、胃酸及胆碱的耐受，所表现出来的结果也较为一致，基本与芽孢率（80 ℃处理10 min）相差不大。因此，试验结果表明，凝结芽孢杆菌ZC-1产生的芽孢对温度、胃酸及胆碱具有较好的耐受能力。但也有研究表明，凝结芽孢杆菌在低pH值环境中抗逆性会下降，后续将继续研究在不同酸性条件下，凝结芽孢杆菌ZC-1对高温、胃酸与胆碱的耐受能力是否改变[32]。4结论探究凝结芽孢杆菌ZC-1的部分生物学特性研究，结果表明，该菌株最适生长温度为40 ℃。菌株不仅能耐受高温、胃酸及胆碱，发酵液能抑制多种畜禽病原菌，且菌株对多种抗生素敏感，对小鼠无毒副作用、无溶血现象。凝结芽孢杆菌ZC-1良好的安全性及抗逆性在饲料加工、畜禽动物保健方面的运用具有广阔前景。