腹泻病发生的原因主要包括药物性、病毒性、细菌性及渗透性腹泻等[1]。临床常见的腹泻多以细菌性腹泻为主，其中致病性大肠杆菌O1（E. coli O1）[2]是犊牛腹泻的主要病原菌，犊牛感染后表现为精神差、食欲不佳、体温升高，脱水排出乳白、灰白、淡黄色浆液状稀便，甚至死亡，给养牛业造成重大损失[3-4]。利用抗生素治疗达不到理想效果，为避免其损害肠道固有菌群及耐药性等，逐渐倾向于应用安全无害的天然草药代替抗生素。草药饲料添加剂具有治疗和补益两方面作用，可以提高免疫及抗病力、改善新陈代谢、促进机体生长发育、提高生产性能[5]，从而增加养殖经济效益[6]。但可以用于预防犊牛腹泻等保育类的草药添加剂的报道较少。课题组前期研究表明，蒙兽药巴布-7草药复方可以调节肠道菌群，有效抑制致病菌生长繁殖，减少肠黏膜损伤，维持机体抗炎免疫力，对腹泻犊牛有良好治疗效果。正交设计筛选的蒙兽药巴布-7草药复方的抑菌、抗炎免疫主要有效成分，得出其成分复方为没食子酸、茜草素、乌苏酸及乳香酸等有效成分[7]。继续对蒙兽药巴布-7有效成分复方在降低犊牛腹泻率及增加抗炎免疫能力进行研究。从犊牛体重、腹泻率、血液中相关免疫因子含量，来论证蒙兽药巴布-7有效成分复方通过早期干预可以维持犊牛抗炎免疫功能，为其作为犊牛饲料添加剂提供依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验药物没食子酸（批号：C11062420）、茜草素（批号：C10774916），均购自上海吉泰依科赛公司；乌苏酸（批号：19120927）购自上海士锋生物科技有限公司；乳香酸（批号：K196821）购自西安开来公司；兽用环丙沙星（批号：20180316）购自成都新亨药业有限公司。1.1.2试验菌株致病性大肠杆菌O1（E. coli O1）为内蒙古农业大学牛生产学实验室从内蒙古地区荷斯坦奶牛粪便中分离纯化的地区优势致病性菌株[8]。1.1.3试验动物试验在内蒙古某牧场进行，选择48头体重为（40.35±3.35）kg健康荷斯坦犊牛。随机分为6组，每组8头。各组犊牛于犊牛岛单独标准化饲养。1.1.4试验仪器菌落计数器（YLN-50A型）、智能化电子称重系统（MP600型，北京东方联鸣科技发展有限公司）、酶标仪（BioTek ELx800型，Biotek美国）等。1.2试验方法1.2.1蒙药巴布-7有效复方制备取没食子酸、茜草素、乳香酸、乌苏酸等7味单药有效成分以课题组研究的比例配伍，各味药独立保存于对应存储温度备用。试验时按比例制成蒙兽药巴布-7有效成分复方混入牛奶饲喂。1.2.2致病性大肠杆菌菌种扩增与菌液的制备将致病性E. coli O1接种至琼脂培养基中，37 ℃培养24 h，挑选形态良好单个菌落按1％接种到营养肉汤，摇床转速150 r/min，37 ℃培养18 h。菌落生长对数期时，伊红美兰琼脂培养基检测菌株，菌落计数器计算大肠杆菌密度制成所需浓度，悬浮液4 ℃保存。1.2.3试验设计及给药方案（见表1）1周龄犊牛饲喂4 L/d牛奶，6：00、19：00两次混入牛奶给药。试验设计及给药方案见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.013.T001表1试验设计及给药方案组别犊牛/只给药方案NC组8灌服无菌生理盐水EC组8灌服无菌生理盐水，连续7 d，2次/d（在第5 d口服给菌）CIP组8灌服50 mg/kg环丙沙星，连续7 d，2次/d（在第5 d口服给菌）BSEIC-L组8灌服1.25 g/kg蒙兽药巴布7有效成分复方，连续7 d，2次/d（在第5 d口服给菌）BSEIC-M组8灌服2.50 g/kg蒙兽药巴布7有效成分复方，连续7 d，2次/d（在第5 d口服给菌）BSEIC-H组8灌服5.00 g/kg蒙兽药巴布7有效成分复方，连续7 d，2次/d（在第5 d口服给菌）1.3测定指标及方法1.3.1体重于犊牛初生时，试验结束时测定记录犊牛体重。1.3.2临床症状、犊牛粪便评分、腹泻情况记录试验期间观察犊牛精神状态、活动力、食欲、进食等情况。犊牛粪便评分数据采集：对每头犊牛每次排出的粪便进行评分，标准见表2。2分（含）以上可认为腹泻。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.013.T002表2粪便评分表外观粪中初水分含量％评分正常，稳固但不坚定的堆或条状外形800轻度，软便、基本成形、比普通粪便黏稠80~851中度，稠状、平状、无粪水分离现象85~902严重，液状、不成形、粪水有分离的现象903根据准则记录每日每头犊牛的粪便情况，计算腹泻率。腹泻率=腹泻头数/总头数×100%(1)1.3.3小肠病理切片制作各组随机处死4头犊牛，立即收集十二指肠、空肠、回肠等组织样品，生理盐水冲洗多余血液杂质，4％多聚甲醛固定液固定，常规方法制作HE切片。1.3.4血液相关免疫指标第7 d末次给药1 h后颈静脉采血，4 ℃冰箱静置过夜，分离血清，-20 ℃保存。ELISA法测定血清TNF－α、IL-1β、IL-6、IL-2、IL-4、IFN-γ含量。1.4数据统计与分析数据采用GraphPad Prism 8.0.2作图，采用Excel 2016处理数据。使用SPSS 23.0统计分析软件进行均值比较和单因素方差（One-way ANOVA）分析，采用Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1蒙兽药巴布-7有效成分复方对腹泻犊牛体重的影响（见表3）由表3可知，给药第0 d，即试验开始的犊牛各组间初生体重分布均匀，无显著差异（P0.05）；给药7 d，与NC组相比，EC组体重显著下降（P0.05），日增重极显著下降（P0.01）；与EC组相比，BSEIC-M组体重和日增重极显著上升（P0.01）；与EC组相比，BSEIC-H组体重显著上升（P0.05），日增重极显著上升（P0.01）；CIP组体重低于NC组及BSEIC-M、H组的体重。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.013.T003表3蒙兽药巴布-7有效成分复方对腹泻犊牛体重的影响组别第0 d体重第7 d体重日增重NC组40.45±1.5845.03±1.70ab0.65±0.04bEC组40.43±2.0642.60±2.27c0.31±0.03dCIP组40.65±2.1344.24±2.35abc0.51±0.04cBSEIC-L组40.25±1.7743.50±1.94bc0.46±0.05cBSEIC-M组40.20±1.6645.76±1.45a0.79±0.10aBSEIC-H组40.40±1.8344.95±2.22ab0.65±0.11b注：同列数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05），相邻字母表示差异显著（P0.05），相间字母表示差异极显著（P0.01）；下表同。kg2.2蒙兽药巴布-7有效成分复方对腹泻犊牛粪便评分及腹泻率的影响（见表4）由表4可知，给药7 d后，EC组犊牛腹泻率最高，达到87.5%。试验期间，犊牛无死亡。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.013.T004表4蒙兽药巴布-7有效成分复方对腹泻犊牛腹泻率和死亡率的影响组别腹泻数/头腹泻率/%死亡数/头死亡率/%NC组0000EC组787.500CIP组225.000BSEIC-L组337.500BSEIC-M组112.500BSEIC-H组225.0002.3蒙药巴布7有效成分复方对腹泻犊牛小肠组织形态的影响（见图1~图3）由图1可知，给药7 d，与NC组相比，EC组十二指肠绒毛之间间隙增大、肠绒毛长度不一致并出现断裂和脱落、肠腺萎缩而稀疏、黏膜下层结缔组织松弛，肠组织形态结构完整性受到破坏。与EC组相比，BSEIC-L组与BSEIC-H组肠绒毛长度基本一致，部分略有脱落，BSEIC-M组肠绒毛排列整齐连接紧密、结构完整。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.013.F001图1BSEIC对犊牛十二指肠组织形态的影响（HE×100）由图2可知，给药7 d，与NC组相比，EC组空肠肠绒毛与肠绒毛之间间隙增大、肠绒毛长度不一致、并出现断裂和脱落，CIP组肠绒毛界限不清，EC组与CIP组肠黏膜固有层肠腺数量增多，黏膜层肌层分离。与EC组相比，所示BSEIC-L组、BSEIC-H组肠绒毛长度基本一致、排列较整齐，部分略有脱落，BSEIC-M组肠绒毛排列整齐连接紧密、结构完整。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.013.F002图2BSEIC对犊牛空肠组织形态的影响（HE×100）由图3可知，给药7 d后，与NC组相比，EC组中回肠肠绒毛与肠绒毛之间间隙增大、界限不清晰、肠绒毛且严重断裂和脱落结构均不完整，不能观察到回肠的正常组织形态。与EC组相比，CIP组与BSEIC-L组、BSEIC-H组肠绒毛形态正常、长度基本一致、排列较整齐，部分略有脱落，BSEIC-M组肠绒毛排列整齐连接紧密、结构完整。说明BSEIC各组具有修复犊牛肠黏膜损伤作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.013.F003图3BSEIC对犊牛回肠组织形态的影响（HE×100）2.4蒙兽药巴布-7有效成分复方对腹泻犊牛血清中炎症细胞因子含量的影响（见表5）由表5可知，给药7 d 后，与NC组相比，EC组犊牛血清中TNF-α、IL-1β与IL-6水平显著或极显著上升（P0.05或P0.01）；与EC组相比，CIP组与BSEIC-M、BSEIC-H组犊牛血清中TNF-α、IL-1β与IL-6水平显著或极显著下降（P0.05或P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.013.T005表5蒙兽药巴布-7有效成分复方对腹泻犊牛血清中炎症细胞因子含量的影响组别TNF-αIL-6IL-1βNC组197.69±7.70c224.07±8.79bc699.38±35.58bcEC组221.33±6.48a251.46±11.44a762.92±29.05aCIP组207.38±9.52bc216.57±8.41c672.29±41.72cBSEIC-L组215.29±11.12ab246.46±14.22a732.71±24.90abBSEIC-M组206.96±8.58bc217.87±7.63bc728.89±31.54bBSEIC-H组198.10±9.20c228.20±10.08b727.85±23.83bng/L2.5蒙兽药巴布-7有效成分复方对腹泻犊牛血清中抗炎细胞因子含量的影响（见表6）由表6可知，给药7 d，与NC组相比，EC组犊牛血清中IFN-γ水平显著降低（P0.05）；与EC组相比，CIP组IFN-γ水平显著升高（P0.05），BSEIC-M组IFN-γ水平呈极显著升高（P0.01）。与NC组相比，EC组血清中IL-2与IL-4水平均显著降低（P0.05）；与EC组相比，BSEIC-M组IL-2水平显著上升（P0.05），IL-4水平极显著上升（P0.01）；BSEIC各组与CIP组的水平差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.17.013.T006表6蒙兽药巴布-7有效成分复方对腹泻犊牛血清中抗炎细胞因子含量的影响组别IFN-γIL-2IL-4NC组980.16±67.66ab290.15±12.51a196.29±10.18abEC组879.38±39.60c272.13±10.34b185.26±8.39cCIP组979.38±74.59ab282.35±10.78ab192.86±7.20abcBSEIC-L组882.50±55.70c271.91±6.81b188.69±7.75bcBSEIC-M组990.31±49.13a293.97±7.41a199.23±6.13aBSEIC-H组921.56±47.74bc283.38±15.00ab188.90±5.78bcng/L3讨论免疫因子在对抗致病菌的免疫反应中起到重要作用。部分白细胞介素和肿瘤细胞因子属于炎症细胞因子，在宿主防御中具有双向免疫调节作用，某些细胞因子水平异常波动时，则出现自身破坏现象[9]。IL-1β是炎性反应过程中一个重要介质[10]，组织受损后其水平升高，同时诱导其他促炎因子释放，促进、维持炎症反应[11]。动物在受到感染时，TNF-α与“恶液素”有关而被独立鉴定[12]。TNF-α是炎症反应在血液循环中的主要参与者，可以诱导形成IL-1、IL-6等各类炎性因子，诱发和扩大炎症反应[13-14]。TNF-α、IL-1、IL-6三者是宿主感染致病菌后急性期反应的介导者[15]，共同促进细胞及体液免疫应答[16]。致病性E. coli O1能够提高血清中TNF-α、IL-6的含量，炎症细胞因子增多、抗炎因子的作用减弱，炎症反应加强而引起犊牛腹泻[17]。使用致病性E. coli O1接种试验小鼠，可以使促炎细胞因子和抗炎细胞因子失衡，加剧炎症反应[18]。本研究中，EC组犊牛血清中TNF-α、IL-1、IL-6的含量较NC组显著升高，说明犊牛口服致病性大肠杆菌会引发炎症。珠蓼散用药使腹泻小鼠血清中IL-6、TNF-α分别下降28.9％和61.3％[19]。珠蓼散能够通过降低炎症因子含量，减轻炎症损伤使腹泻得以控制。使用蒙兽药巴布-7有效成分复方对攻毒犊牛治疗后，犊牛血清中致炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β水平显著降低达到正常对照组水平，说明蒙兽药巴布-7有效成分复方能通过降低炎症因子、减轻炎症损伤，使腹泻得以控制。致病性E. coli O1使犊牛肠组织形态改变[20]、局部肠黏膜免疫屏障、机械屏障功能受损[21]导致腹泻发生，推测腹泻犊牛十二指肠黏膜结构形态得以维持可能与BSEIC减轻炎症损伤作用有关。Th1、Th2的失衡是感染病原微生物的重要依据[22]，在机体调节免疫平衡时发挥着重要作用。Th1细胞主要释放的INF-γ、IL-2[23]等免疫细胞因子，可以增强吞噬细胞介导的抗感染免疫，抑制感染的发展[24]。IL-4是1种多效性细胞因子，在抗原递呈及淋巴细胞激活过程中起重要作用。另外作用于静止的B细胞时，能够促进B细胞增殖[25]，诱导B细胞合成免疫球蛋白E（IgE），增强巨噬细胞活性。IFN-γ可以动员NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，进入活化状态，参与免疫调节。致病性E. coli O1侵袭，导致机体抵抗力下降，免疫系统被破坏。贾知锋等[17]使用致病性E. coli O1犊牛致其腹泻后测得血清中IFN-γ、IL-2、IL-4含量均显著降低，IL-6、TNF-α含量则升高，可知E. coli O1侵袭使犊牛抗炎因子含量降低，炎症因子水平上升，两者失衡，机体出现炎症反应。本研究中，致病性E. coli O1入侵会导致犊牛体内IL-4、IL-2和IFN-γ水平下调，说明致病性E. coli O1使犊牛机体免疫稳态失调，免疫因子高水平释放，导致炎症反应加剧。蒙兽药巴布-7成分复方治疗后，BSEIC治疗组可以不同程度维持或上调犊牛血清中IL-4、IL-2和IFN-γ水平，抑制IL-6、IL-1和TNF-α持续产生，BSEIC对炎症因子及抗炎因子维持动态平衡及增强抗炎免疫力有着积极作用。致病性E. coli O1攻毒的EC组犊牛腹泻率高达到87.5%。与EC组相比，BSEIC药物治疗干预的各组犊牛腹泻率降至25%~35%，说明BSEIC各组能够有效控制犊牛腹泻，降低腹泻率。犊牛试验期EC组体重增加和日增重显著低于NC组，BSEIC-M组、BSEIC-H较EC组有显著和极显著升高趋势。试验结束时，各给药组与NC组体重水平相当，已知BSEIC各组对腹泻犊牛的治疗效果与CIP组相当，但CIP组体重低于NC组的体重，说明虽然CIP对致病性大肠杆菌导致的犊牛腹泻病具有一定的治疗作用，但对犊牛体重不能达到NC组体重水平。故而推测用抗生素干预致病性E. coli O1导致的犊牛腹泻病的治疗效果与蒙兽药巴布-7有效成分复方的治疗效果不可比肩，蒙药有望代替抗生素应用于动物的治疗与保护[26]。蒙药巴布-7有效成分复方具有预防并减缓炎症反应、调节免疫力、增强机体抗病力的作用。可以有效避免因致病性大肠杆菌侵袭对犊牛肠道黏膜的损伤，维持肠道完整性、促进电解质与水平衡，使犊牛腹泻症状缓解，降低腹泻；增强免疫力使受致病性大肠杆菌侵袭的肠上皮细胞吸收功能恢复并维持正常，改善营养吸收情况，有利于犊牛体重增加。4结论蒙兽药巴布-7有效成分复方能够有效治愈致病性大肠杆菌导致的犊牛腹泻，降低死亡率，其中中剂量效果最佳，可以维持炎症因子及抗炎因子处于动态平衡，增强抗炎免疫力，改善并保护十二指肠肠黏膜，保证犊牛营养摄入，有效维持或增加犊牛体重。