甘草是豆科甘草属植物，甘草根入药，具有清热解毒、止渴祛痰、补脾和胃及调和诸药等功效[1]。甘草种植过程中产生大量的茎叶。冯建忠等[2]指出，人工种植的甘草第2年后，枯黄期甘草茎叶产量可达753 kg/667 m2。潘奥[3]报道，二次刈割甘草茎叶对甘草根的影响不显著，甘草茎叶产量达到550 kg/667 m2。枯黄期甘草茎叶的营养成分（干物质基础）为：粗蛋白13.01%、粗脂肪4.53%、中性洗涤纤维49.40%、酸性洗涤纤维38.92%、粗灰分6.51%、钙1.73%、磷0.16%[4]，具有较高的饲喂价值。甘草茎叶具有抗炎、解毒、抗过敏、增强新陈代谢、提高免疫力和增加营养吸收等功能，可以改善日粮口味，增强牲畜食欲，提高畜产品品质[5-7]。目前，对甘草茎叶在畜牧业中的应用研究主要集中于绵羊和奶牛生产性能[2,8-14]、免疫力[9-13]和饲料报酬[14]。甘草茎叶对反刍动物瘤胃发酵参数和瘤胃微生物的影响鲜有报道。文章就饲喂甘草茎叶对瘤胃发酵参数和瘤胃微生物的影响进行研究，以期为甘草茎叶在奶牛生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验设计在奎屯一三一团奶牛场，选择20头健康的泌乳后期（258±12）d的荷斯坦奶牛，根据产奶量、分娩时间和胎次进行配对试验设计。试验牛分对照组（苜蓿添加组）和试验组（甘草茎叶添加组），每组10个重复。试验期共4 w，预试期1 w，正式试验期3 w。1.2饲养管理对照组日粮为一三一团奶牛场泌乳后期日粮，试验组采用枯黄期甘草茎叶替代紫花苜蓿。试验日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.005.T001表1试验日粮组成及营养水平 （干物质基础）原料组成/%对照组试验组营养水平对照组试验组合计100.00100.00青贮玉米23.1123.14粗蛋白/%14.4214.57紫花苜蓿18.430粗脂肪/%2.964.86甘草茎叶018.32中性洗涤纤维/%72.9481.42甜菜粕5.335.34酸性洗涤纤维/%36.0733.89配方精料44.1544.21钙/%0.380.56棉籽6.876.88磷/%0.430.44过瘤胃脂肪1.511.51产奶净能/(MJ/kg)7.036.99小苏打0.600.60注：1.配方精料购自天康饲料科技有限公司。2.营养水平均为实测值。试验奶牛分组自由采食、自由饮水，每天饲喂3次，每天挤奶2次。1.3瘤胃液样品的采集与分析正试验期的第21 d晨饲4 h后，采用瘤胃液口腔采样方法[7]采取瘤胃液，迅速分装。取8 mL瘤胃液，加入2 mL新配制的25%偏磷酸，封盖，倒置，摇匀，在11 000×g下离心20 min，取上清液采用次氯酸钠-苯酚法测定氨态氮（NH3-N）浓度[15]，采用气相色谱法测定瘤胃挥发性脂肪酸（VFA）[15]。另取50 mL瘤胃液分装至10 mL塑料离心管中，液氮保存，备用。1.4Real-time PCR定量瘤胃液目标菌种1.4.1瘤胃微生物总DNA的提取利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）提取瘤胃液微生物DNA，并对所提取DNA浓度进行检测。1.4.2DNA质量检测采用细菌通用引物F27 5'-AGAGTTTGATCMTGGC TCAG-3'，R1492 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'检测DNA质量[16]。PCR反应体系为：10×缓冲液2.5 μL、dNTP（各2.5 mmol/L）2 μL、10 pmol/L的引物各1.0 μL、模板2 μL、TaqDNA聚合酶2.5 U、ddH2O为16 μL，总体积25 μL。PCR反应参数：94 ℃ 变性3 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火50 s，72 ℃ 延伸2 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。1.4.3引物选用（见表2）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.005.T002表2瘤胃液目的菌PCR引物目标菌种引物序列（5'→3'）Tm/℃文献来源琥珀酸丝状杆菌上游GGCGGGATTGAATGTACCTTGAGA60Yang等[17]下游TCCGCCTGCCCCTGAACTATC解脂厌氧弧菌上游AGACACGGCCCAAACTCCTACG60Yang等[17]下游TCCTCCTTGACCCATTTCCTGA反刍兽新月形单胞菌上游TGCTAATACCGAATGTTG53Tajima等[18]下游TCCTGCACTCAAGAAAGA白色瘤胃球菌上游GTTTTAGGATTGTAAACCTCTGTCTT60Yang等[17]下游CCTAATATCTACGCATTTCACCGC总普雷沃氏菌上游GGTTCTGAGAGGAAGGTCCCC60Stevenson等[19]下游TCCTGCACGCTACTTGGCTG黄色瘤胃球菌上游GATGCCGCGTGGAGGAAGAAG60Yang等[17]下游CATTTCACCGCTACACCAGGAA总瘤胃球菌上游GAGTGAAGTAGAGGTAAGCGGAATTC60Stevenson等[19]下游GCCGTACTCCCCAGGTGG溶纤维丁酸弧菌上游GTTCGGCTGGGCACTCT60Yang等[17]下游CACCGCGACATTCTGATTC引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.4.4PCR条件建立及引物的检测（见图1）普通PCR反应体系为：Mixture 12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、DNA模板1 μL、ddH2O为10.5 μL，总体积25 μL。反应参数：95 ℃变性3 min；95 ℃变性30 s，Tm温度退火30 s，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。瘤胃液DNA中目的菌种的扩增见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.005.F001图1瘤胃液DNA中目的菌种的扩增注：M为Maker DL2000，1为Selenomonas ruminantium，2为Ruminococcus flavefaciens，3为Genus ruminococcus，4为Ruminococcus albus，5为Butyrivibrio fibrisolvens，6为Genus prevotella，7为Fibrobacter succinogenes，8为Anaerovibrio lipolytica。1.4.5实时定量PCR标准曲线的构建以及PCR的检测分析参照Koike等[20]的方法进行质粒的连接、转化和阳性克隆的筛选。含有目的菌基因片段的大肠杆菌TOP10感受态细胞的单克隆菌液送至工生物工程（上海）股份有限公司测序分析验证。质粒DNA浓度采用Beckman DU800核酸分析仪测定。将含有每个目的菌的质粒DNA稀释成10 ng后，依据公式计算拷贝数[21]，再进行8个梯度的稀释（107、106、105、104、103、102、10和空白），每梯度3个重复。使用LightCycler® 480实时定量PCR仪进行标准曲线的构建。拷贝数浓度(拷贝/mL)=(质量/分子量)×6.02×1023 (1)反应条件为：起始循环时，变性温度为95 ℃ 10 min；95 ℃变性15 s，Tm温度退火33 s，40个循环；72 ℃延伸1 min。利用ABI公司荧光定量PCR仪7500的SDS软件建立标准曲线。每个目的菌按构建标准曲线。12孔条板逐条排列分成标准孔和检测孔，每个样品重复3次。样品的定量采用LightCycler® 480实时定量PCR仪进行检测。每个目的菌实时定量PCR扩增条件和扩增体系与标准曲线的条件相同。1.5数据统计与分析数据基本处理采用WPS 2016软件，统计分析采用SAS 9.0 T-test模型进行F检验，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1饲喂甘草茎叶对瘤胃发酵参数的影响（见表3）由表3可知，试验组乙酸、丙酸和戊酸浓度均极显著高于对照组（P0.01），丁酸浓度显著高于对照组（P0.05）。试验组乙酸/丙酸比显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.005.T003表3饲喂甘草茎叶对瘤胃发酵参数的影响项目对照组试验组SEM值P值氨氮/(mmol/L)4.645.770.480.120乙酸/(mmol/L)42.6057.402.690.006丙酸/(mmol/L)11.1816.640.860.001异丁酸/(mmol/L)1.111.020.070.390丁酸/(mmol/L)6.338.390.510.030异戊酸/(mmol/L)1.461.330.120.510戊酸/(mmol/L)0.761.080.060.003乙酸/丙酸3.813.450.100.0162.2饲喂甘草茎叶对瘤胃细菌数量的影响（见表4）由表4可知，试验组的白色瘤胃球菌、总瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌的数量均显著低于对照组（P0.05）。试验组黄色瘤胃球菌的数量极显著低于对照组（P0.01）。甘草茎叶替代苜蓿具有提高琥珀酸丝状杆菌数量的趋势，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.18.005.T004表4饲喂甘草茎叶对瘤胃细菌数量的影响 单位：lgcopies/μL项目对照组试验组SEM值P值产琥珀酸丝状杆菌2.673.100.160.070解脂厌氧弧菌4.754.750.111.000反刍兽新月形单胞菌4.164.480.190.250白色瘤胃球菌4.534.200.080.012总普雷沃氏菌6.656.680.100.821总瘤胃球菌5.825.570.080.034黄色瘤胃球菌5.865.600.060.007溶纤维丁酸弧菌5.775.500.070.0163讨论3.1饲喂甘草茎叶对瘤胃发酵参数的影响挥发性脂肪酸（VFA）是反刍动物主要的能量来源，是日粮碳水化合物（纤维素、半纤维素和淀粉等）在瘤胃中发酵的产物，约占反刍动物吸收能量的70%~80%。VFA中产生数量最多的脂肪酸是乙酸，其次是丙酸和丁酸；乙酸、丙酸和丁酸占瘤胃发酵总VFA的95%左右[22]。日粮组成和饲喂制度对瘤胃VFA含量影响很大，日粮含易消化碳水化合物和蛋白质多，则VFA水平高；而饲喂低质粗饲料时，瘤胃发酵水平低，VFA产量少[23]。VFA比例主要受日粮精粗比的影响，日粮结构相似则瘤胃的各VFA的比例和含量均相似[24]。本试验日粮组分中，除用甘草茎叶替代苜蓿外，其他日粮组分相近。结果表明，试验组的乙酸、丙酸、戊酸和丁酸的浓度均高于对照组。郭雪峰等[25]研究甘草提取物对绵羊瘤胃体外发酵及甲烷产量的影响，发现甘草提取物添加组的乙酸和丙酸浓度均低于对照组。丙酸和乙酸的比例与代谢能的利用效率呈线性关系（r=0.927 4），即丙酸所占比例越高，效率越高[22]。试验组的瘤胃中乙酸/丙酸的比值降低，说明日粮中添加甘草茎叶可能有利于提高饲草料的利用效率。3.2饲喂甘草茎叶对瘤胃细菌数量的影响总瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌是瘤胃中的主要的纤维降解菌。谢宝昌等[26]研究30种中药对瘤胃细菌的影响，发现甘草具有抑制纤维分解菌的作用。本试验中使用甘草茎叶替代苜蓿饲喂奶牛可降低总瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌的数量，说明甘草茎叶也具有抑制瘤胃纤维分解菌的作用。3.3瘤胃发酵参数和瘤胃细菌数量变化的关系瘤胃VFA生成比例和利用效率、发酵产热及甲烷生成主要受瘤胃微生物的影响，而瘤胃VFA生成比例和利用效率、发酵产热及甲烷生成的变化又影响动物对饲粮中能量的利用效率[22,25]。溶纤维丁酸弧菌具有降解纤维降解酶、淀粉降解酶和蛋白降解酶的活性，其发酵产物主要为乙醇、乙酸、丁酸、甲酸、乳酸二氧化碳和氢气。黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是瘤胃中的主要纤维降解菌，能够产生大量的纤维素酶和半纤维素酶，黄色瘤胃球菌的发酵产物为大量的乙酸、甲酸和琥珀酸以及少量的乙醇、乳酸和氢气。白色瘤胃球菌的发酵产物为大量的氢气和乙醇以及少量的乳酸。产琥珀酸丝状杆菌也是瘤胃内的主要纤维降解细菌，具有较强的纤维降解能力，其发酵产物通常为乙酸和琥珀酸。本研究中，作为主要淀粉分解菌的反刍兽新月形单胞菌和总普雷沃氏菌数量虽然甘草茎叶组比苜蓿组高，但差异不显著。反刍兽新月形单胞菌的产物为乙酸和丙酸，其生长需戊酸、二氧化碳和B族维生素。总普雷沃氏菌的发酵产物主要为乙酸、丙酸和琥珀酸，其中丙酸主要通过丙烯酸途径合成[22]。本试验中，虽然甘草茎叶抑制纤维分解菌的数量，但同时也增加量反刍兽新月形单胞菌、总普雷沃氏菌和产琥珀酸丝状杆菌的数量。这可能是导致甘草茎叶添加组乙酸、丙酸、戊酸和丁酸的浓度提高、乙酸/丙酸的比值变小、日粮利用效率提高的原因。郭雪峰等[25]研究发现，甘草提取物对瘤胃甲烷的产生有抑制作用，有利于发酵，与本研究结论相似。4结论日粮中添加甘草茎叶对瘤胃液中的纤维分解菌白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌和总瘤胃球菌具有抑制作用，对纤维分解菌产琥珀酸丝状杆菌的数量有增加的趋势。日粮中添加甘草茎叶能够提高瘤胃内乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的浓度，降低乙酸/丙酸的比值，有利于提高饲草料的利用效率。